इस प्रोटोकॉल में एक सिंगल गाइड आरएनए को एक गाइड आरएनए समामेल वेक्टर में क्लोन करने के लिए कदमों का वर्णन किया गया है, जो सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 तकनीक का उपयोग करते हुए बहु-जीन नॉकआउट्स बनाने में विशेष रूप से इस्तेमाल होता है। आंतों के इनोगोइड्स में डबल नॉकआउट्स की पीढ़ी इस पद्धति का एक संभावित आवेदन के रूप में दिखाया गया है।
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 टेक्नोलॉजी ने हानि समारोह के अध्ययन की व्यवहार्यता और गति में काफी सुधार किया है जो कि जीन फ़ंक्शन को समझने में आवश्यक हैं। उच्च यूकेरियोट्स में, पैरालॉजस जीन एक जीन के नुकसान की क्षतिपूर्ति करके एक संभावित फेनोटाइप को मुखौटा कर सकता है, इस प्रकार इस जानकारी को सीमित कर सकता है जिसे एकल जीन नॉकआउट पर निर्भर आनुवंशिक अध्ययन से प्राप्त किया जा सकता है। हमने माउस छोटे आंत्र जीवों में अभिकर्मक के एक दौर के बाद बहु-जीन नॉकआउट बनाने के लिए गाइड आरएनए (जीआरएनए) कंटेमेटर के लिए एक उपन्यास, तीव्र क्लोनिंग विधि विकसित की है। हमारी रणनीति एक एकल वेक्टर में चार अलग-अलग जीआरएनए के संवेदीकरण के लिए अनुमति देती है जो एनेल्ड जीआरएनए ऑलिगोस और पूर्व डिज़ाइन रेट्रोवायरल वेक्टर के साथ एकल गोल्डन गेट फेरबदल प्रतिक्रिया कर रही है। यह या तो एकाधिक जीआरएनए द्वारा एक जीन के लक्ष्यीकरण के बाद चार अलग-अलग जीनों के साथ-साथ नॉकआउट या नॉकआउट क्षमता में वृद्धि करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से दिखाते हैंरेट्रोवाइरल क्र्रिस्प-संकिता वेक्टर में एकाधिक जीआरएनए को प्रभावी ढंग से कैसे क्लोन करना है और आंतों के इनोगोइड्स में अत्यधिक कुशल इलेक्ट्रोप्लायेशन कैसे हासिल करना है। एक उदाहरण के रूप में, हम यह दिखाते हैं कि दो जोड़े जीन के साथ-साथ, Wnt सिग्नलिंग मार्ग (एक्सिन 1/2 और आरएनएफ 43 / जेएनआरएफ 3) के नकारात्मक नियामक एन्कोडिंग प्रमुख वृद्धि कारकों को वापस लेने के लिए प्रतिरोधी आंतों के ऑर्गोइओड्स को रेखांकित करता है।
रिवर्स आनुवंशिकी दृष्टिकोण एक जीन के कार्य की जांच करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। विशेष रूप से, हानि समारोह की पढ़ाई, जिसमें एक जीन के विघटन में फेनोटाइपिक परिवर्तन होता है, जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ के निर्माण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 विधि जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी में सबसे हालिया प्रगति का प्रतिनिधित्व करती है और कोशिकाओं और जीवों में आनुवंशिकी के वर्तमान अभ्यास को क्रांति लाती है। सीएस 9 एक आरएनए-निर्देशित एंडोन्यूक्लिज़ है जो जीआरएनए के पूरक के लिए एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम को बांधता है और डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करता है। यह डीएसबी डीएनए मरम्मत मशीनरी को भर्ती करता है, जो मुताबिक़ पुनर्संरचना के लिए डीएनए टेम्पलेट की अनुपस्थिति में, त्रुटि-प्रवण गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने के माध्यम से कट डीएनए स्ट्रैंड को फिर से बाएं लगीगी, जिससे न्युक्लिओटाइड (एस) के सम्मिलन या विलोपन का परिणाम हो सकता है फ्रेशिफ़्ट म्यूटेशन 1 के कारण
सीआरआईएसपीआर / कैस 9 एफ़ की महान सहजता और बहुमुखी प्रतिभाओच ने जीनोम स्तरीय नॉकआउट स्क्रीन के लिए यह बेहद आकर्षक उपकरण बना दिया है जिसका लक्ष्य अज्ञात जीन फ़ंक्शन 2 , 3 को सुलझाना था। फिर भी, एकल जीन नॉकआउट दृष्टिकोण सीमित उपयोग के होते हैं, यदि निरर्थक कार्यों के साथ कई समानुभूतियां मौजूद हैं। इस प्रकार, एक जीन को अपहरण करने से उस जीन के कार्य को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है, जिसके द्वारा पैरोलोजेस द्वारा संभव मुआवजा दिया गया था, जिसके परिणामस्वरूप थोड़ा या कोई परिवर्तन नहीं हुआ 4 । इसलिए आनुवंशिक मुआवजे के प्रभाव पर काबू पाने के लिए अलग-अलग पैरालॉजस जीन को लक्षित करने वाले कई जीआरएनए वैक्टर वितरित करके समांतर में समानुभूतियां खारिज करना महत्वपूर्ण है।
सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 के प्रयोग को अनुवांशिक जीन नॉकआउट में बढ़ाने के लिए, हमने हाल ही में एक रेट्रोवायरल वेक्टर 5 में चार प्री-एनेल्ड जीआरएनए को क्लोन करने के लिए एक तेज़, एक-चरण क्लोनिंग पद्धति विकसित की है। सीआरआईएसपीआर- कंटेटेमर नामक रीढ़ की हड्डी, आधारित हैएक एमएससीवी रेट्रोवायरल प्लास्मिड जिसमें दोहराव वाले जीआरएनए अभिव्यक्ति केट शामिल हैं। प्रत्येक कैसेट प्रकार के दो औंधा मान्यता साइटों IIS प्रतिबंध एंजाइम Bbs मैं, जो अपरिवर्तनीय मिलान overhangs एक एकल ट्यूब 6 में एक गोल्डन गेट फेरबदल प्रतिक्रिया का उपयोग कर के साथ एक annealed gRNA oligo द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इस क्लोनिंग पद्धति में पाचन और बंधन के पुनरावृत्त चक्र होते हैं जो बीबीएस I द्वारा उत्पन्न विभिन्न ओवरहेंग अनुक्रमों का शोषण करके कई डीएनए टुकड़ों की एक साथ विधानसभा की अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, इस एंजाइम की विशिष्टता इसकी मान्यता के बाहर असममित कटौती करने की क्षमता है अनुक्रम; इसलिए, प्रत्येक कैसेट Bbs मैं मूल साइट अगल अनुकूलित overhangs के साथ एक अलग अनुक्रम हो सकता है और इस तरह से, प्रत्येक gRNA concatemer वेक्टर के एक विशिष्ट स्थान और अभिविन्यास में क्लोन किया जा सकता है।
सिद्धांत के एक प्रमाण के रूप में, हमने इस रणनीति में इसका उपयोग करने का प्रदर्शन कियामाउस इन्टेस्टाइनल ऑर्गोऑइड, एक साथ इलेक्ट्रोपार्जन 5 के एक राउंड द्वारा विंट मार्ग के पैरालॉस नकारात्मक नियामकों के एक साथ दो जोड़े को बाधित करके।
पिछले कुछ वर्षों के दौरान, कई अन्य समूहों ने कई जीआरएनए अभिव्यक्ति वैक्टर के आधार पर विकसित किया है जो गोल्डन गेट का उपयोग कर 7 में कई मॉडल प्रणालियों में मल्टी-जीन नॉकआउट हासिल करने के लिए बनाई गई है, जैसे मानव सेल लाइन 8 , 9 , zebrafish 10 और Escherichia coli 11 अपने प्रोटोकॉल में, जीआरएनए को पहली बार मध्यवर्ती वैक्टर में क्लोन किया जाता है और फिर एक अंतिम उत्पाद में इकट्ठा किया जाता है। इसके विपरीत, हमारे सीआरआईएसपीआर-कंटेटेमर रणनीति का मुख्य लाभ एक एकल बीबीएस मैं फेरबदल, क्लोनिंग चरण की सुविधा है। अन्य जीआरएनए कंसटाइमर्स की तरह, हमारी विधि या तो चार तक के साथ-साथ नॉकआउट संभव बनाती हैकई जीआरएनए ( चित्रा 1 ) के साथ एक या दो जीन के लक्ष्यीकरण के बाद विभिन्न जीन या बढ़ी हुई क्रिस्प्र पीटकर दक्षता।
इस प्रोटोकॉल में, हम सीआरआईएसपीआर-कंटेटेमीर वैक्टर की पीढ़ी के हर चरण में जीआरएनए डिजाइन से गोल्डन गेट प्रतिक्रिया तक और सफल क्लोनिंग की पुष्टि के लिए विस्तार से वर्णन करते हैं। हम इलेक्ट्रोपायरिंग और बाद के विकास कारक वापसी प्रयोगों द्वारा माउस छोटे आंतों के आर्गोइड्स में सीआरआईएसपीआर-कॉलेटाइमर्स के अभिकर्मक के लिए एक अत्यधिक कुशल प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम सीआरआईएसपीआर-कॉस्मेटर्स को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक सभी कदमों का विस्तार करते हैं और माउस आंतों के ऑर्गेनाइएड्स में सीआरआईएसपीआर-कॉम्टाटाइमर्स को लागू करने के लिए एक साथ कई जीनों को बाहर निकालते हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस रणनीति में कई फायदे हैं, जैसे कि इसकी गति, उच्च दक्षता और लागत-प्रभावशीलता।
पूरी प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पूरा करने के लिए, विचार करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं। सबसे पहले, यह जरूरी है कि सभी gRNA ओलिगोस ठीक से annealed हैं और फॉस्फोरिलेटेड है, के रूप में वे प्रतिक्रिया क्लोनिंग अपने आप में बहुत ही कुशल है कि Bbs मैं के लिए शुरू कर सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं। दूसरे, जब इलेक्ट्रोफोरेटिंग ऑ organoids, अधिक प्रति कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं, अधिकतम संभव अभिकर्मक दक्षता उच्च। इसके अलावा, यह भी महत्वपूर्ण है कि कोशिका के पृथक्करण के बाद, छोटे कोशिका समूहों एकल कोशिकाओं पर प्रबल हो जाते हैं।
फिर भी, तकनीकी समस्या का सामना करना संभव हैपहली बार क्लोनिंग या अभिकर्मक का प्रयास करते समय लीम; जीआरएनए क्लोनिंग के दौरान समस्याओं के मामले में, जीआरएनए ओलिगो अनुक्रम को दोबारा जांचने की सिफारिश की जाती है, और अगर सही हो, प्रतिबंध पाचन स्क्रीनिंग के लिए अतिरिक्त बैक्टीरियल कॉलोनियों का चयन करें। यदि अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता कम-पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन हैं, तो यह प्रति शर्त अधिक कोशिकाओं का उपयोग कर प्रोटोकॉल को दोहराने और 3 मिनट तक सेल विस्थापन के समय को कम करने की सलाह दी जाती है।
हालांकि सीआरआईएसपीआर-कंसटाइमर्स की पीढ़ी अपेक्षाकृत सस्ता और आसान है, ऑर्गनोइड में बड़े पैमाने पर आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करना नहीं है, क्योंकि पैमाने पर ऑनोनोइड संस्कृति से जुड़े लागत और श्रम-गहन प्रकृति द्वारा सीमित है। इस मामले में उल्लेखनीय रूप से उल्लेखनीय है कि सीआरआईएसपीआर-कंसाटेमर विधि सेल लाइनों जैसे एचई 2 9 3 और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ भी संगत है।
सेलुलर सिस्टम के बावजूद, इस एस के एक और संभावित दोषतीन या चार अलग-अलग जीनों के साथ-साथ नॉकआउट करने पर ट्राटेजी का सामना करना पड़ सकता है। उदाहरण के लिए, प्रत्येक जीआरएनए में एक अलग लक्ष्यीकरण दक्षता होगी और एक ही समय में सभी जीनों को मारने के बदलाव अपेक्षाकृत कम हो सकते हैं; इस कारण से, एक ही जीन के खिलाफ एक से अधिक जीआरएनए को निर्देशित करने के लिए सम्मेलन प्रणाली को नियोजित करने की सलाह दी जाती है।
मल्टीप्लेक्स जीआरएनए वैक्टर 7 , 8 को उत्पन्न करने के लिए इसी तरह गोल्डन गेट फेरबदल पर आधारित वैकल्पिक रणनीतियों को प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, हमारे पद्धति में क्लोनिंग के एक ही दौर में एक एकल रेट्रोवायरल वेक्टर में कई जीआरएनए को सीधे इकट्ठा करना संभव है, जो जीआरएनए लाइब्रेरियों को पैरोलोजेस को लक्षित करने के लिए उपयुक्त बनाता है।
हमारे सीआरआईएसपीआर-कंटेटेमेटर एमएससीवी रेट्रोवायरल वेक्टर बैकबोन में बनाया गया है। इस प्रकार, जीआरएनए समामेलर वाले रेट्रोवायरस का उपयोग स्थिर सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो ओवरएक्सपीरेस जीआरएनए जब Cas9-inducible प्रणाली के साथ संयुक्त, एक हमारे सिस्टम का उपयोग कर inducible paralogue knockouts प्रदर्शन कर सकते हैं।
संक्षेप में, हम यहां बताते हैं कि एक ही सदिश में एक ही सदिश में चार अलग-अलग जीआरएनए को क्लोन कैसे करें और उच्च अभिकर्मक दक्षता के साथ organoid संस्कृति को इस रणनीति को कैसे लागू किया जाए। इसके अलावा, हम पूरी प्रक्रिया में सफलता की संभावना को अधिकतम करने के लिए उपयोगी सुझाव प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए क्रिस्टोफर हिंडले को धन्यवाद करते हैं। एएम Wntsapp (मैरी क्यूरी आईटीएन), एए-आर द्वारा समर्थित है चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी), और बीके के द्वारा समर्थित है। और आरएम वेलकम ट्रस्ट और रॉयल सोसाइटी [101241 / जेड / 13 / जेड] से सर हेनरी डेल फेलोशिप द्वारा समर्थित हैं और वे वेलकम ट्रस्ट और एमआरसी से वेलकम ट्रस्ट – एमआरसी कैम्ब्रिज स्टेम सेल इंस्टीट्यूट ।
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |