Denne protokollen beskriver trinnene for kloning av flere enkle guide-RNAer i en guide RNA-concatemer-vektor, som er spesielt nyttig for å skape multi-gen-knockouts ved hjelp av CRISPR / Cas9-teknologi. Genereringen av dobbelt knockouts i tarmorganoider er vist som en mulig anvendelse av denne metoden.
CRISPR / Cas9-teknologien har kraftig forbedret muligheten og hastigheten til tap av funksjonstudier som er avgjørende for å forstå genfunksjonen. I høyere eukaryoter kan paralogøse gener maske en potensiell fenotype ved å kompensere tapet av et gen, og dermed begrense den informasjonen som kan oppnås fra genetiske studier som stole på enkeltgenutslag. Vi har utviklet en roman, rask kloning metode for guide RNA (gRNA) concatemers for å skape multi-gene knockouts etter en enkelt transfeksjon i mus-tarmorganoider. Vår strategi gjør det mulig for concatemerization av opptil fire individuelle gRNAer i en enkelt vektor ved å utføre en enkelt Golden Gate-shufflingreaksjon med annealed gRNA oligos og en pre-designet retroviral vektor. Dette tillater enten samtidig utkobling av opptil fire forskjellige gener eller økt utkoblingseffektivitet etter målretting av ett gen av flere gRNAer. I denne protokollen viser vi i detaljHvordan klone flere gRNAer effektivt i den retrovirale CRISPR-concatemer-vektoren og hvordan å oppnå høy effektiv elektroporasjon i tarmorganoider. Som et eksempel viser vi at samtidig utkobling av to par gener kodende negative regulatorer av Wnt signalveien (Axin1 / 2 og Rnf43 / Znrf3) gjør intestinale organoider resistente mot tilbaketrekking av viktige vekstfaktorer.
Omvendt genetikk tilnærming er en mye brukt metode for å undersøke funksjonen av et gen. Spesielt undersøkelser av tap av funksjon, hvor forstyrrelse av et gen forårsaker fenotypiske forandringer, spiller en nøkkelrolle i å bygge vår forståelse av biologiske prosesser. CRISPR / Cas9-metoden representerer den nyeste fremskriden innen genomteknikkteknologi og har revolusjonert gjeldende praksis for genetikk i celler og organismer. Cas9 er en RNA-styrt endonuklease som binder til en spesifikk DNA-sekvens komplementær til gRNA og genererer en dobbeltstrengspaus (DSB). Denne DSB rekrutterer DNA-reparasjonsmaskineri som, i fravær av en DNA-mal for homolog rekombination, vil re-ligere den kuttede DNA-streng via feilkrenkelig, ikke-homolog sluttendring, noe som dermed kan resultere i innsetting eller deletjon av nukleotid (er) Forårsaker fremdriftsmutasjoner 1 .
Den store brukervennligheten og allsidigheten til CRISPR / Cas9 apprOach har gjort det til et svært attraktivt verktøy for genome-skala knockout skjermer rettet mot unraveling ukjente genfunksjoner 2 , 3 . Ikke desto mindre er enkle genknockout tilnærminger av begrenset bruk hvis flere paraloger med overflødige funksjoner eksisterer. Således kan ablatering av et enkelt gen ikke være nok til å bestemme funksjonen til det genet gitt mulig kompensasjon av paraloger som resulterer i liten eller ingen fenotypisk forandring 4 . Det er derfor viktig å slå ut paraloger parallelt ved å levere flere gRNA-vektorer rettet mot de forskjellige paraloggenene for å overvinne påvirkning av genetisk kompensasjon.
For å utvide bruken av CRISPR / Cas9 til paralogous gen-knockout, har vi nylig utviklet en rask, en-trinns kloningsmetode for å klone opp til fire pre-annealed gRNAs i en enkelt retroviral vektor 5 . Ryggrad, som heter CRISPR-concatemer, er basertPå et MSCV retroviralt plasmid som inneholder repeterende gRNA ekspresjonskassetter. Hver kassett inneholder to omvendte gjenkjennelsessteder av Type IIS-restriksjonsenzymet Bbs I, som kan erstattes irreversibelt med en glødet gRNA-oligo med tilhørende overheng ved bruk av en Golden Gate-shuffling-reaksjon i et enkeltrør 6 . Denne kloningsmetoden består av repeterende sykluser av fordøyelse og ligering som tillater samtidig montering av flere DNA-fragmenter ved å utnytte de forskjellige overhengssekvenser generert av Bbs I. Uniktheten til dette enzymet er for eksempel evnen til å utføre asymmetriske kutt utenfor sin anerkjennelse sekvens; Derfor kan hver kassett ha en annen sekvens med tilpasset overheng flankerende Bbs I kjerneområde og på denne måten kan hver gRNA klones i en spesifikk posisjon og orientering av concatemervektoren.
Som bevis på prinsippet demonstrerte vi bruken av denne strategien iMus intestinale organoider ved å forstyrre samtidig to par av paralog negative regulatorer av Wnt-banen med en runde av elektroporasjon 5 .
I løpet av de siste årene har mange andre grupper utviklet lignende strategier basert på flere gRNA ekspressionsvektorer konstruert ved hjelp av Golden Gate shuffling 7 for å oppnå multi-gen-knockout i forskjellige modell systemer, for eksempel humane cellelinjer 8 , 9 , sebrafisk 10 og Escherichia coli 11 . I deres protokoller klones først gRNAer i individuelle mellomproduktvektorer og samles deretter sammen i ett sluttprodukt. I motsetning til dette er den viktigste fordelen av vår CRISPR-concatemer-strategi enkelheten til et enkelt Bbs I-shuffling, kloningstrinn. I likhet med andre gRNA concatemers, gjør vår metode det mulig enten samtidig utslag på opptil fireForskjellige gener eller økt CRISPR knockout effektivitet etter målretting av ett eller to gener med flere gRNAer ( Figur 1 ).
I denne protokollen beskriver vi i detalj hvert trinn i genereringen av CRISPR-concatemervektorer, fra gRNA-design til Golden Gate-reaksjonen og til bekreftelse på vellykket kloning. Vi gir også en svært effektiv protokoll for transfeksjon av CRISPR-concatemers i mus-tynne organoider ved hjelp av elektroporasjon og påfølgende vekstfaktor tilbaketrekkingsforsøk.
I denne protokollen detaljerer vi alle trinnene som er nødvendige for å generere CRISPR-concatemers og å anvende CRISPR-concatemers i muskeltarmorganoider for samtidig å slå ut flere gener. Som tidligere nevnt har denne strategien flere fordeler, for eksempel hastighet, høy effektivitet og kostnadseffektivitet.
For å kunne utføre hele prosedyren, er det noen kritiske aspekter å vurdere. Først er det avgjørende at alle gRNA-oligos er riktig annealed og fosforylert, da de representerer utgangsmaterialet for Bbs I-kloningsreaksjonen som i seg selv er svært effektiv. For det andre, når de elektroporerende organoider, jo flere celler som brukes per tilstand, jo høyere er maksimal mulig transfeksjonseffektivitet. I tillegg er det også viktig at etter celledissociering dominerer småcelleklynger over enkeltceller.
Likevel er det mulig å støte på teknisk probLemer når man prøver enten kloning eller transfeksjon for første gang; I tilfelle problemer under gRNA kloning, anbefales det å dobbeltsjekke gRNA oligosekvensen og, hvis det er riktig, velge ytterligere bakteriekolonier for restriksjonsfordøyelses screening. Hvis transfeksjonseffektivitet og cellelevedannelse er lav etter elektroporasjon, er det tilrådelig å gjenta protokollen ved å bruke flere celler per tilstand og redusere tiden for celledissociering til 3 minutter.
Selv om genereringen av CRISPR-concatemers er relativt billig og enkel, er det ikke å utføre større skala genetiske skjermbilder i organoider, da skalaen er begrenset av kostnadene forbundet med organoid kultur og av arbeidsintensiv natur. Det er verdt å nevne at CRISPR-concatemer-metoden også er kompatibel med cellelinjer, for eksempel HEK293 og musembryoniske stamceller.
Uavhengig av cellesystemet, en annen potensiell ulempe ved denne sTrategy kan oppstå når man sikter mot samtidig utkobling av tre eller fire forskjellige gener. For eksempel vil hver gRNA ha en annen målrettingseffektivitet, og endringene av å treffe alle generene på samme tid kan være relativt lave; Av denne grunn er det tilrådelig å benytte concatemer-systemet til å lede mer enn ett gRNA mot det samme genet.
Alternative strategier basert på Golden Gate shuffling har blitt foreslått gjennom årene for å generere multiplex gRNA vektorer 7 , 8 . I vår metode er det imidlertid mulig å montere flere gRNAer direkte i en enkelt retroviral vektor i en enkelt kloning, noe som gjør den egnet til å generere gRNA-biblioteker for å målrette paraloger.
Vår CRISPR-concatemer er bygd i den MSCV retrovirale vektorgraden. Således kan gRNA-concatemer-holdig retrovirus brukes til å generere stabile cellelinjer som overexplodererRess gRNAer. Når det kombineres med et Cas9-inducerbart system, kan man utføre inducerbare paralog-knockouts ved hjelp av vårt system.
Sammendrag beskriver vi hvordan man klonrer opptil fire forskjellige gRNAer i samme vektor i ett trinn og hvordan man bruker denne strategien til organoidkultur med høy transfeksjonseffektivitet. Videre gir vi nyttige forslag for å maksimere sjansene for suksess gjennom hele prosedyren.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christopher Hindley for kritisk lesing av manuskriptet. AM støttes av Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Støttes av Medical Research Council (MRC), og BK.K. Og RM støttes av en Sir Henry Dale fellesskap fra Wellcome Trust og Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] og mottar støtte gjennom et kjernebidrag fra Wellcome Trust og MRC til Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Institute .
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |