Detta protokoll beskriver stegen för kloning av flera enkla styr-RNA i en guide RNA-concatemervektor, som är särskilt användbar för att skapa multi-gen-knockouts med CRISPR / Cas9-teknik. Genereringen av dubbla knockouts i tarmorganoider visas som en möjlig tillämpning av denna metod.
CRISPR / Cas9-tekniken har avsevärt förbättrat genomförbarhetsstudien och hastigheten för studier av förlust av funktion som är nödvändiga för att förstå genfunktionen. I högre eukaryoter kan paralogena gener maskera en potentiell fenotyp genom att kompensera förlusten av en gen, vilket begränsar informationen som kan erhållas från genetiska studier med utgångspunkt i gengenomslag. Vi har utvecklat en ny, snabb kloningsmetod för guiden RNA (gRNA) concatemers för att skapa multi-gen-knockouts efter en enda transfektion i mus-tarmorganoider. Vår strategi möjliggör concatemerization av upp till fyra individuella gRNAs i en enda vektor genom att utföra en enda Golden Gate-shufflingreaktion med glödgade gRNA-oligos och en förkonstruerad retroviral vektor. Detta möjliggör antingen samtidig utslagning av upp till fyra olika gener eller ökad knockout-effektivitet efter inriktning av en gen av flera gRNA. I det här protokollet visar vi i detaljHur man effektivt klonar flera gRNA i den retrovirala CRISPR-concatemervektorn och hur man uppnår högeffektiv elektroporation i tarmorganoider. Som ett exempel visar vi att simultant knockout av två par gener som kodar negativa reglerare för Wnt-signalvägen (Axin1 / 2 och Rnf43 / Znrf3) gör intestinala organoider resistenta mot återkallandet av viktiga tillväxtfaktorer.
Omvänd genetik är en allmänt använd metod för att undersöka genens funktion. I synnerhet studier av förlust av funktion, där störning av en gen orsakar fenotypiska förändringar, spelar en nyckelroll för att bygga upp vår förståelse för biologiska processer. CRISPR / Cas9-metoden representerar den senaste utvecklingen inom genomtekniksteknik och har revolutionerat den nuvarande praxisen av genetik i celler och organismer. Cas9 är ett RNA-styrt endonukleas som binder till en specifik DNA-sekvens komplementär till gRNA och genererar en dubbelsträngspaus (DSB). Denna DSB rekryterar DNA-reparationsmaskiner som, i avsaknad av en DNA-mall för homolog rekombination, kommer att ligga om den skurna DNA-strängen via felaktigt icke-homologa ändförbindelser, vilket sålunda kan resultera i införande eller deletioner av nukleotid (er) Orsakar framväxlingsmutationer 1 .
Den stora användarvänligheten och mångsidigheten hos CRISPR / Cas9 apprOach har gjort det till ett mycket attraktivt verktyg för genomskala knockout skärmar som syftar till att unraveling okända genfunktioner 2 , 3 . Ändå är enkla genknockout-tillvägagångssätt av begränsad användning om flera paraloger med överflödiga funktioner existerar. Således kan ablatering av en enda gen inte vara tillräcklig för att bestämma funktionen hos den genen som ges möjlig kompensation genom paraloger, vilket resulterar i liten eller ingen fenotypisk förändring 4 . Det är därför viktigt att utjämna paraloger parallellt genom att leverera flera gRNA-vektorer riktade mot de olika paraloggenerna för att övervinna påverkan av genetisk kompensation.
För att utvidga användningen av CRISPR / Cas9 till paraloggengenknockout har vi nyligen utvecklat en snabb, enstegs kloningsmetod för att klona upp till fyra förutglödda gRNA i en enda retroviral vektor 5 . Ryggraden, som heter CRISPR-concatemer, är baseradPå en MSCV retroviral plasmid innehållande repetitiva gRNA-expressionskassetter. Varje kassett innehåller två inverterade igenkänningsställen av typ IIS-restriktionsenzymet Bbs I, som kan ersättas irreversibelt med en glödgad gRNA-oligo med matchande överhängningar med användning av en Golden Gate-shufflingreaktion i ett enda rör 6 . Denna kloningsmetod består av repetitiva cykler av digestion och ligering som möjliggör simultan montering av multipla DNA-fragment genom att utnyttja de olika överhängningssekvenser som genereras av Bbs I. Uniktheten hos detta enzym är exempelvis förmågan att utföra asymmetriska skärningar utanför dess igenkänning sekvens; Därför kan varje kassett ha en annan sekvens med anpassad överhängningsflankerande Bbs I- kärnplats och på detta sätt kan varje gRNA klonas i en specifik position och orientering av concatemervektorn.
Som ett bevis på principen visade vi användningen av denna strategi iMus-intestinala organoider genom att samtidigt störa två par av paraloga negativa regulatorer av Wnt-vägen genom en omgång elektroporering 5 .
Under de senaste åren har många andra grupper utvecklat liknande strategier baserade på multipla gRNA-expressionsvektorer konstruerade med användning av Golden Gate-shuffling 7 för att uppnå multigen-knockout i olika modellsystem, såsom humana cellinjer 8 , 9 , zebrafisk 10 och Escherichia coli 11 . I sina protokoll klonas först gRNA i enskilda mellanliggande vektorer och monteras sedan ihop i en slutprodukt. Däremot är den huvudsakliga fördelen med vår CRISPR-concatemer-strategi bekvämligheten av ett enda Bbs I-shuffling-kloningsteg. Liksom andra gRNA concatemers, möjliggör vår metod antingen simultant knockout på upp till fyraOlika gener eller ökad CRISPR knockout-effektivitet efter inriktningen av en eller två gener med flera gRNA ( Figur 1 ).
I detta protokoll beskriver vi i detalj varje steg i genereringen av CRISPR-concatemervektorer, från gRNA-design till Golden Gate-reaktionen och till bekräftelse av framgångsrik kloning. Vi tillhandahåller också ett högeffektivt protokoll för transfektion av CRISPR-concatemers i mus-lilla tarmorganoider genom elektroporation och efterföljande tillväxtfaktoravdragsförsök.
I det här protokollet detaljerar vi alla steg som är nödvändiga för att generera CRISPR-concatemers och att tillämpa CRISPR-concatemers i muskeltarmorganoider för att samtidigt slå ut flera gener. Som tidigare noterat har denna strategi flera fördelar, såsom dess hastighet, hög effektivitet och kostnadseffektivitet.
För att framgångsrikt kunna utföra hela proceduren finns det några kritiska aspekter att överväga. För det första är det väsentligt att alla gRNA-oligos är ordentligt glödgade och fosforylerade, eftersom de representerar utgångsmaterialet för Bbs I-kloningsreaktionen som i sig är mycket effektivt. För det andra, när elektroporiserande organoider, ju fler celler som används per tillstånd, desto högre är maximal möjlig transfektionseffektivitet. Dessutom är det också viktigt att efter celldissociation dominerar småcells-kluster över enskilda celler.
Det är emellertid möjligt att stöta på teknisk probLems när man försöker antingen kloningen eller transfektionen för första gången; I fallet med problem vid gRNA-kloning rekommenderas att dubbelkontrollera gRNA-oligosekvensen och, om det är korrekt, välja ytterligare bakteriekolonier för screening av restriktionsmältning. Om transfektionseffektivitet och cellleabilitet är låg efter elektroporering, är det lämpligt att upprepa protokollet med användning av flera celler per tillstånd och reducera tiden för celldissociation till 3 min.
Trots att genereringen av CRISPR-concatemers är relativt billigt och lätt, är det inte nödvändigt att utföra större skala genetiska skärmar i organoider, eftersom skalan begränsas av kostnaderna för organoidkultur och av dess arbetsintensiva natur. Det är värt att nämna i detta fall att CRISPR-concatemer-metoden också är kompatibel med cellinjer, såsom HEK293 och musembryonala stamceller.
Oavsett cellens system, en annan potentiell nackdel med detta sTrategy kan uppstå när man syftar till simultant knockout av tre eller fyra olika gener. Till exempel kommer varje gRNA att ha en annan inriktningseffektivitet och förändringarna av att träffa alla gener samtidigt kan vara relativt låga; Av detta skäl är det lämpligt att använda concatemersystemet för att rikta mer än ett gRNA mot samma gen.
Alternativa strategier baserade på Golden Gate-shuffling har föreslagits genom åren för att generera multiplex gRNA-vektorer 7 , 8 . I vår metod är det emellertid möjligt att direkt montera flera gRNA i en enda retroviral vektor i en enda klonkloning, vilket gör den lämplig för att generera gRNA-bibliotek för att rikta paraloger.
Vår CRISPR-concatemer är byggd i den MSCV retrovirala vektorns ryggraden. Således kan gRNA-concatemerinnehållande retrovirus användas för att alstra stabila cellinjer som överexploderarRes gRNA. När det kombineras med ett Cas9-inducerbart system kan man utföra inducerbara paralog-knockouts med vårt system.
Sammanfattningsvis beskriver vi hur man klonar upp till fyra olika gRNA i samma vektor i ett steg och hur man tillämpar denna strategi på organoidkultur med hög transfektionseffektivitet. Dessutom ger vi användbara förslag för att maximera chanserna för framgång under hela förfarandet.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Christopher Hindley för kritisk läsning av manuskriptet. AM stöds av Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Stöds av Medical Research Council (MRC) och BK.K. Och RM stöds av ett Sir Henry Dale Fellowship från Wellcome Trust och Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] och får stöd genom ett kärnbidrag från Wellcome Trust och MRC till Wellcome Trust – MRC Cambridge Stem Cell Institute .
Optimized CRISPR Design Tool | Feng Zhang group | CRISPR gRNA design tool; http://crispr.mit.edu/ | |
Webcutter 2.0 | restriction mapping tool; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ | ||
T4 PNK (Polynucleotide Kinase) | New England Biolabs | M0201L | |
T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | M0202S | |
T7 DNA Ligase | New England Biolabs | M0318L | |
DTT (dithiothreitol) | Promega | P1171 | |
ATP (adenosine triphosphate) | New England Biolabs | P0756S | |
FastDigest BbsI (BpiI) | Thermo Fisher | FD1014 | |
Tango buffer (BSA-containing restriction enzyme buffer) | Thermo Fisher | BY5 | |
BglII | New England Biolabs | R0144 | |
EcoRI | New England Biolabs | R0101 | |
Plasmid-safe exonuclease | Cambio | E3101K | |
Thermal cycler | Applied biosystems | 4359659 | |
10G competent E. coli bacteria | Cambridge Bioscience | 60108-1 | |
Plasmid mini kit | Qiagen | 12125 | |
Table top microcentrifuge | Eppendorf | UY-02580-01 | |
Inoculating loops | Microspec | PLS5 | |
Bacteria incubator | Sanyo | MIR-262 | |
Luria-Bertani broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3522 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
Agarose gel electrophoresis apparatus | Bioneer | A-7020 | |
Advanced DMEM/F12(cell culture medium) | Invitrogen | 12634-034 | |
Glutamax (L-Glutamine) 100x | Invitrogen | 35050-068 | |
HEPES 1 M (buffering agent) | Invitrogen | 15630-056 | |
Penicillin-streptomycin 100x | Invitrogen | 15140-122 | |
B27 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 50x | Invitrogen | 17504-044 | |
N2 supplement (Neuronal cell serum-free supplement) 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
n-Acetylcysteine 500 mM | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Mouse EGF 500 µg/mL | Invitrogen Biosource | PMG8043 | |
Mouse Noggin 100 µg/mL | Peprotech | 250-38 | |
Nicotinamide 1 M | Sigma | N0636 | |
R-Spondin conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Wnt conditioned medium | n.a. | n.a. | Produced in house from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013 |
Y-27632 10 µM | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
Standard BD Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
48-well Plate | Greiner Bio One | 677980 | |
CHIR99021 | Sigma-Aldrich | A3734-1MG | |
IWP-2 | Cell Guidance Systems | SM39-10 | |
TrypLE (recombinant protease) | Invitrogen | 12605-010 | |
Opti-MEM (reduced serum medium ) | Life technologies | 51985-034 | |
Electroporation Cuvettes 2mm gap | NepaGene | EC-002S | |
Low binding 15 mL tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
Bürker’s chamber | Sigma-Aldrich | BR719520-1EA | |
NEPA21 Super Electroporator | NepaGene | contact supplier | |
Protein LoBind tubes low binding | Thermo Fisher | 10708704 | |
BTXpress electroporation buffer | Harvard Apparatus | 45-0805 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | AppliChem | A3672 |