Denne protokol viser en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow-stretching assay for at studere endimensional (1D) udbredelse af molekyler langs DNA.
Vi beskriver en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow-stretching assay for at studere 1D diffusion af molekyler langs DNA. I denne analyse, er glas coverslips functionalized i en et-trins reaktion med silan-PIND-biotin. Flow celler er opbygget af sandwiching en selvklæbende tape med præ-cut kanaler mellem en functionalized coverslip og en PDMS slab indeholdende indsugnings- og udstødningsporte huller. Flere kanaler er integreret i ét flow celle og strømmen af reagenser til hver kanal kan være fuldt automatiseret, hvilket betydeligt øger assay overførselshastighed og reducerer hands-on tid pr. assay. Inde i hver kanal, biotin-λ-DNAs er immobiliseret på overfladen og en laminar flow er anvendt for at flow-strækning de udpegede nationale myndigheder. DNA-molekyler er strakt til > 80% af deres contour længde og tjene som rumligt udvidet skabeloner for at studere de bindende og transport aktivitet af fluorescently mærket molekyler. Baner af enkelt molekyler spores af time-lapse Total interne Reflection fluorescens (JOHANNAS) billeddannelse. RAW-billeder er analyseret ved hjælp af strømlinede brugerdefinerede enkelt partikel tracking software til automatisk identificere baner af enkelt molekyler spreder langs DNA og vurdere deres 1D diffusion konstanter.
En mangeårige problem i biologi er hvordan endogene proteiner, der virker på specifikke steder i genomet kan finde deres DNA mål hurtigt nok for organismen at overleve og reagere effektivt på sine omgivelser. Undersøgelser i de sidste fyrre år har foreslået og i høj grad støtte den hypotese, at kinetik af DNA målrette søgning af et protein kan fremskyndes ved lettet diffusion som proteinet veksler mellem 3D diffusion i bulk og 1D diffusion (herunder glidende og hopping processer) langs DNA1. Det er nu kendt, at mange proteiner involveret i genregulering, nukleinsyre metabolisme og andre processer er i stand til at glide på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Derudover rapporterede nylige undersøgelser, at selv små peptider kan binde til og glide på DNA, med evnen til at transportere en last; for eksempel, et protein molekyle eller PCR primer, langs DNA10,11,12,13,14.
I de sidste 15 år, har enkelt molekyle flow-stretching assay været udbredt at studere bindende og diffusion af molekyler langs DNA2,15,16. I denne type analyse, biotinylated dobbelt-strenget DNA molekyler er immobiliseret på overfladen og en laminar flow anvendes til flow strække DNA. Den > 80% strakt DNAs tjene som rumligt udvidede skabeloner for at studere bindende og transport aktivitet af molekyler, mærket med fluorophores hvor baner af enkelt molekyler langs DNA spores af time-lapse fluorescens billeddannelse. I vores gennemførelse, optimeret til reproducerbarhed og brugervenlighed, denne analyse består af fem store skridt: forberedelse af biotin-λ-DNA, coverslip functionalization, flow celle konstruktion, fluorescens billedbehandling og analyse af data. I tidligere protokoller17, blev glas coverslips functionalized af første reagerer med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) og derefter med Amin-reaktiv polyethylenglycol (PEG) reagenser (fx NHS-PIND-biotin) til at danne en PIND lag, der modstår uspecifik adsorption af assay komponenter til coverslip overflade. Kvaliteten af functionalized coverslips afhang i høj grad kvaliteten af PIND reagenser og reaktionsbetingelser på hvert trin. Vores protokol beskriver en forenklet functionalization protokol og multiplex flow celle konstruktion, som kræver ingen flydende lim eller helbredelse tid på dagen flow celler er samlet. Vi beskriver også en strømlinet og robust data analyse procedure11 der fjerner beregningskrævende regression trin ved at anvende en radial symmetri metode for barycentrum lokalisering18 og en Kovarians-baserede diffusion konstant estimator19.
Her rapporterer vi en enkel, robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle flow strækker assay gennemførelse med betydelige forbedringer i coverslip functionalization, flow celle konstruktion og analyse af data. Navnlig, udviklede vi en et-trins coverslip functionalization protokol, hvori rene og tørre coverslips reagere direkte med silan-PIND-biotin. Denne protokol forenkler coverslip forberedelse og forbedrer pålideligheden af kvaliteten af functionalized overflader i forhold til standard totrins reaktion protokol. Vi beskriver brug af så functionalized coverslips med multi-kanal PDMS flow celler, der giver mulighed for robust slanger forbindelser skal foretages uden lim. Disse flow celler yderligere omfatter flere computer-kontrollerede fjorde for kamrene strøm som aktiverer automatiseret reagens flow til at reducere hands-on tid under opsætning og øget assay overførselshastighed.
Når du skifter fra traditionelle to-trins coverslip functionalization reaktion protokol til en et-trins reaktion protokol, bemærket vi, at pålideligheden af coverslip functionalization er væsentligt forbedret. Da den samlede hands-on tid for coverslip forberedelse er mindre end 30 min, anbefaler vi forbereder friske coverslips hver dag enkelt molekyle imaging er planlagt. For at minimere forværring af silan-PIND-biotin, skal reagenset aliquoted og opbevares under tørre N2 gas ved-20 ° C ved modtagelsen. Her bruger vi ikke PIND molekyler, der producerer -COO– eller -CH3 terminal grupper, der har været brugt i de sidste20. De negative afgifter -COO– grupper og de hydrofobe -CH3 grupper blev udnyttet til at forhindre uspecifik adsorption af DNA-molekyler og specifikke protein prøver til overfladen, henholdsvis. Vi observerer meget lav overflade adsorption af lille peptid prøver på den fuldt biotin-afsluttet PLØK overflade, mens silan-PIND-COOH og/eller silan-PIND-CH3 kan være nyttige for assays af visse protein prøver eller Hvornår assay betingelser (såsom pH < 7,5) fremme DNA-overflade interaktioner.
Skift fra glas dias flow celler til PDMS flow celler hastigheder op flow celle konstruktion og giver mulighed for nem integration af flere kanaler. Vi ingeniør ofte otte kanaler pr. flow celle aktivere otte uafhængige forsøg pr. functionalized coverslip. For at øge gennemløb pr. coverslip, kunne endnu større antal mikro-fabrikeret kanaler bruges.
Det er tilrådeligt at undgå luft boble dannelse inde kanalen på ethvert tidspunkt efter indledende påfyldning. Normalt, luftbobler ikke forårsager tab af tøjret DNAs (selv om dette er muligt), men snarere afbryde strømmen og muligvis forårsage DNAs at holde sig til coverslip. Buffer afgasning og tilsætning af små overfladeaktivt mængder er typisk effektive til at forebygge boble dannelse inden for slanger og flow-kanal. I tilfælde hvor luftbobler er introduceret til slangen, forsøge at skylle boblerne ud under en langsom flow og sørg for, at de ikke flyder gennem regionen hvor DNAs er tøjret.
En strømlinet og effektiv data analyse software er kritisk, på grund af den enorme mængde af data, der genereres. Vi indsamler normalt 700.000 højopløsningsbilleder fra målinger på en flow-celle, som kan behandles ved hjælp af vores tilpassede enkelt partikel tracking software inden for en dag på en stationær computer med en quad-core processor og 32 Gb hukommelse. Den falske positive sats af afsløre 1 D diffusion baner af softwaren (trin 5.5) er udsnit afhængige og kan være ganske lav da: 1) tætheden af én partikler i FOV er lav nok, så der er lidt uklarhed forbinder partikler på tværs af frames ( protein prøver generelt er mere tilbøjelige til uspecifikke adsorption til coverslip end peptid prøver, og således bufferen og effekttæthed for hvert protein prøve skal optimeres); 2) signalet støjforhold af én partikler er høj nok, så sandsynligheden for falske-identifikation af partikler er lav. Stadig, softwaren kan gøre lejlighedsvis fejl, og vi anbefaler manuel kontrol af data, der anvender den medfølgende GUI til at evaluere software ydeevne. I et program, der er særligt følsomme over for falsk-positive bane påvisning, kan procesparametre herunder tærskelværdi, minFrames, minTriplets og Chi2_stat indstilles mere stringent på bekostning af lavere følsomhed for sande bindende begivenheder og potentielt større statistiske bias i bane identifikation. Vi her deler og beskrive vores enkelt partikel tracking software med håb om at hjælpe standardisere data analysemetoder og stimulere diskussionen om bedste praksis.
I vores protokol, som kræver kontinuerlig flow under imaging for at opretholde den strakte tilstand af DNA skabelon molekyler, kunne den flydende flow skævhed transport af nogle proteiner langs DNA skabeloner, hvis de diffuse af en hopping mekanisme, eller hvis den hydrodynamiske radius af mærket fluorophore er store22,23. Mens sådanne bias kan måles og korrigeret i de fleste datasæt, transport af proteiner markeret med et lille fluorophore og spreder af en glidende mekanisme er ikke typisk forudindtaget påviselige omfang af flow2,4, 24. Især er virkningen af strømningshastighed på transport af proteiner langs DNA blevet brugt til at studere mekanismerne af protein spreder langs DNA23. A tæt relaterede alternativ tilgang, der giver mulighed for målinger i mangel af flow udnytter DNA skabeloner med biotin på både termini, forbigående strakte sig i flow og tøjret ved begge ender til coverslip sådan at DNA molekylerne forbliver i en udvidet konfiguration når strømmen er slukket25,26,27,28. Dobbelt-tether fremgangsmåde har fordelen, at flow-gratis transport eksperimenter men kræver ændring af begge ender af DNA skabelon molekyler, omhyggelig flow-styring under tethering, og kendetegner afstande mellem de to tøjrede sites. Derudover vurderes virkningen af heterogene spændinger og DNA konformationelle dynamikker på tværs af DNA molekyler på enkelt-molekyle assay.
Helt, ud over at studere 1 D diffusion af molekyler langs DNA, som rapporterede enkelt molekyle assay kan gavne mange i vitro biokemiske og biofysiske undersøgelser på enkelt-molekyle niveau herunder DNA målrette søgeprocesser af proteiner, enzymaktiviteter på DNA, og meget mere.
Fejlfinding
Problem 1: Flow-kanaler lække.
Løsning: Først, sørge for, at udformningen af flow kanaler giver mindst 1,5 mm margen for forsegling omkring og mellem kanaler; og derefter, under montagen af cellen flow, Sørg for at støtteflade mellem coverslip, dobbelt-klæbende tape og PDMS slab er flad, tør og fri for snavs, at pression for at danne en forsegling er ensartet, og at handlingen forsegling er udføres ved stuetemperatur.
Problem 2: Tætheden af tøjret DNAs er for lavt.
Løsning: Dette problem opstår, når PIND functionalization effektivitet er lav eller DNA-molekyler er ikke functionalized med biotin. Fra vores erfaring, tætheden af tøjret DNA bør være høje for > 90% af coverslips fremstillet af friske eller opbevares korrekt silan-PIND-biotin reagens. I tilfælde når massefylden af tøjret DNA er lav med en dokumenteret batch af biotin-λ-DNA, prøv øge koncentrationer af silan-PIND-biotin under PIND functionalization og koncentrationer af streptavidin og biotin-λ-DNA under DNA tethering. Hvis dette mislykkes, erstatte PIND og streptavidin reagenserne.
Opgave 3: DNAs holde sig til coverslip end kan ikke strækkes ved flow.
Løsning: Dette problem kan også opstå, når PIND functionalization effektivitet er lav, og forværres af lav assay pH. Prøv flyder i flere BSA eller hæve pH (fx til 8,0) for at hjælpe undertrykke DNA adsorption på overfladen (trin 4.3.2). Hvis DNA adsorption er et vedvarende problem under en bestemt assay tilstand, prøve, herunder op til 90% silan-PIND-COOH under PIND functionalization.
DATA ANALYSENOTER:
Vi bruger brugerdefinerede enkelt partikel tracking software til at identificere baner af enkelt molekyler spreder langs DNA, fra som deres 1D diffusion konstanter, D1 anslås. For at forbedre dataanalyse, gennemført vi radial symmetri algoritme18 for lokalisering af partikler og Kovarians-baserede estimator19 til estimering 1 D diffusion konstanter, som dramatisk drønede op dataanalyse uden at gå på kompromis nøjagtighed. Vi tidligere har valideret den brugerdefinerede software ved at analysere simulerede data11. De vigtigste trin er beskrevet nedenfor.
Partikel identifikation:
Dette trin er for at opdage og segmentering af partikler – diffraktion-begrænset steder – fra baggrunden. Først, rumligt sporgruppe-pass filter billederne for at forbedre signal af partikler i 3-5 pixel området (hvilket svarer til størrelsen af punkt-opslag funktionen på vores system) og derefter tærskel baseret på intensitet (Se script: spt2_SD_sandbox.m).
Barycentrum tildeling
Segmentering billedet kun lokaliserer molekyler til pixel-niveau rumlige opløsning. For at lokalisere molekyler til meget højere præcision, ansætte Radial symmetri super opløsning algoritme18 billeder filtreret som ovenfor. (Denne metode er baseret på en analytisk beregning og dermed langt reducerer beregningsmæssige byrde sammenlignet med andre populære high-præcision metoder såsom 2D Gaussisk montering (Se script: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikel sporing:
For at spore banen af en partikel gennem tiden, skal vi igen identificere de samme partikler, når de bevæger sig mellem rammer. Vi anser de indledning, blinker og opsigelse stadier at være komponenter af en bane. Vi begrænse sammenkædning af partikler i nuværende rammer dem vises i tidligere rammer ved den maksimale forskydning tilladt pr. ramme. I tilfælde, hvor flere forbindelser er muligt, Jonker-Volgenant algoritme bruges til at give globalt optimal kobling sæt (Se script: traceTraj4_kx.3.m).
D1 skøn:
Du skal vurdere D1 værdier fra baner, bruger vi Kovarians-baserede Estimator (CVE)19. Baseret på en analytisk beregning, denne metode er mere beregningsmæssigt effektiv og statistisk streng end andre almindeligt anvendte metoder såsom regression af gennemsnitlig kvadrerede forskydninger (Se script: runspt5_SD.m).
Bane filtrering:
Nogle baner indeholder artefakter såsom kobling til overfladen-bundne molekyler og skal fjernes. Vi implementeret flere funktioner såsom minimal forskydning parallel til DNA, maksimal forskydning tværgående til DNA, minimale længde af bane, minimalt antal triplet træk opdaget positioner og mindste sandsynlighed score (Se Xiong et al11 definition) der kan være filtreret til at isolere et minimalt forudindtaget sæt af baner tilbøjelige til at repræsentere molekyler spreder på DNA (Se script: sptViewFig2_update3x.m).
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick og Evangelos Gatzogiannis for assistance med indledende instrumentation opsætning og afprøvning. Vi takker yderligere Tony Kulesa for betydelig hjælp skriftligt og evaluere den tilpassede enkelt partikel tracking software. Dette arbejde blev støttet af startup finansiering og en karriere Award på den videnskabelige Interface (til PCB) fra Burroughs Wellcome Foundation.
Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
Script programming software | MathWorks | Matlab | |
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |