Denne protokollen demonstrerer en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyt-stretching analysen for å studere endimensjonal (1D) spredning av molekyler langs DNA.
Vi beskriver en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyt-stretching analysen for å studere 1D spredningen av molekyler langs DNA. I denne analysen, er glass coverslips functionalized i en ettrinns reaksjon med silane-PEG-biotin. Flyt celler er konstruert av sandwiching et limbånd med pre-cut kanaler mellom en functionalized dekkglassvæske og en PDMS plate som inneholder innløp og utløp hull. Flere kanaler er integrert i en flyt celle og flyten av reagenser i hver kanal kan være fullt automatisert, noe som vesentlig øker analysen og reduserer hands-on tid per analysen. Innenfor hver kanal, biotin-λ-DNAs er immobilized på overflaten og en laminær strømning brukes flyt strekke DNAs. DNA-molekyler er strukket til > 80% av sine omkrets og tjene som romlig utvidet maler for å studere og transport og aktiviteten til fluorescently merket molekyler. Baner av enkelt molekyler spores av time-lapse Total intern refleksjon fluorescens (TIRF) tenkelig. Rå bildene analyseres ved hjelp strømlinjeformet egendefinerte enkelt partikkel sporing automatisk identifisere baner enkelt molekyler spre langs DNA og beregne sine 1D diffusjon konstanter.
Et langvarig problem i biologi er hvordan endogene proteiner som fungerer på spesifikke områder i genomet finner deres DNA mål raskt nok for organismen overleve og reagere effektivt omgivelsene. Studier de siste førti årene foreslått og i stor grad støtte hypotesen at the kinetics av DNA målet søk av et protein kan akselereres ved tilrettelagt diffusjon som protein veksler mellom 3D spredning i bulk og 1D diffusjon (inkludert skyve og hopper prosesser) langs DNA1. Det er nå kjent at mange proteiner involvert i genet regulering, nukleinsyre metabolisme og andre prosesser kan skyve på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Videre rapportert studier at selv små peptider kan binde til og skyv på DNA, muligheten til å bære en Last; for eksempel en protein molekyl eller PCR primer, langs DNA,10,,11,,12,,13,,14.
De siste 15 årene, har ett molekyl flyt-stretching analysen vært mye brukt bindende og spredningen av molekyler langs DNA2,15,16. I denne analysen, biotinylated double-strandet DNA molekyler er immobilisert til overflaten og en laminær strømning gjelder flyt strekke DNA. Den > 80% strukket DNAs tjene som romlig utvidet maler for å studere og transport og aktivitet av molekyler merket med fluorophores hvor baner av enkelt molekyler langs DNA spores av time-lapse fluorescens tenkelig. I gjennomføringen, optimalisert for reproduserbarhet og brukervennlighet, denne analysen består av fem hovedtrinn: utarbeidelse av biotin-λ-DNA, dekkglassvæske functionalization, flyt celle konstruksjon, fluorescens bildebehandling og dataanalyse. I tidligere protokoller17, var glass coverslips functionalized av første reagerer med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) og deretter med Amin-reaktive polyetylenglykol (PEG) reagenser (f.eks NHS-PEG-biotin) å danne et PEG-lag som motstår Uspesifisert adsorpsjon analysen komponenter til dekkglassvæske overflaten. Kvaliteten på functionalized coverslips er i stor grad avhengig av kvaliteten på pinne reagenser og reaksjonen forhold på hvert trinn. Våre protokollen beskriver en forenklet functionalization protokollen og multiplex flyt celle konstruksjon som krever ingen flytende lim eller herding tid på dagen flyt cellene er samlet. Vi beskriver også en strømlinjeformet og robust analyse prosedyren11 som eliminerer beregningsmessig intensiv regresjon trinn ved å bruke en radial symmetri metode for centroid lokalisering18 og en kovariansen-baserte diffusjon konstant estimator19.
Her rapporterer vi en enkel, robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering med betydelige forbedringer i dekkglassvæske functionalization, flyt celle konstruksjon og dataanalyse. Spesielt utviklet vi en ettrinns dekkglassvæske functionalization protokoll, som ren tørr coverslips reagere direkte med silane-PEG-biotin. Dette forenkler dekkglassvæske utarbeidelse og forbedrer stabiliteten til kvaliteten på functionalized overflater sammenlignet med standard totrinns reaksjon protokollen. Vi beskriver bruken av slik functionalized coverslips med flerkanals PDMS flyt celler som aktiverer robust rør tilkoblinger gjøres uten lim. Disse flyt cellene ytterligere inkluderer flere datastyrt viker for hvert flyt kammer som aktiverer Automatiske reagens flyt redusere hands-on tid under Oppsett og økt analysen gjennomstrømming.
Når du bytter fra tradisjonelle to-trinns dekkglassvæske functionalization reaksjon protokollen til en ettrinns reaksjon protokoll, la vi merke til at påliteligheten av dekkglassvæske functionalization er forbedret. Når den totale hands-on dekkglassvæske forberedelse er mindre enn 30 min, anbefaler vi forbereder frisk coverslips hver dag ett molekyl imaging er planlagt. For å minimere forverring av silane-PEG-biotin, skal reagensen aliquoted og lagret under N2 gassen på 20 ° C ved mottak. Her bruker vi ikke PEG molekyler som produserer -COO– eller -CH3 terminal grupper som er brukt i de siste20. Negative kostnadene av -COO– og de hydrofobe -CH3 gruppene ble benyttet for å hindre uspesifikke adsorpsjon av DNA molekyler og bestemt protein prøver til overflaten, henholdsvis. Vi observerer svært lav overflaten adsorpsjon ved liten peptid eksempler på fullt biotin slutter PEG overflaten, mens silane-PEG-COOH og/eller silane-PEG-CH3 kan være nyttig for analyser av visse protein prøver eller når analysen forhold (for eksempel pH < 7.5) fremme DNA-overflate interaksjoner.
Skiftet fra glass lysbilde flyt celler til PDMS flyt cellene raskere flyt celle konstruksjon og gir enkel integrasjon av flere kanaler. Vi ingeniør ofte åtte kanaler per flyt celle aktivere åtte uavhengig eksperimenter per functionalized dekkglassvæske. For å øke gjennomstrømming per dekkglassvæske, kan enda større antall mikro-fabrikkert kanaler brukes.
Det anbefales å unngå luft boble dannes inne kanalen når som helst etter første utfyllingen. Vanligvis luftbobler ikke forårsaker tap av bundet DNAs (selv om dette er mulig), men heller avbryte flyt og skape DNAs å holde seg til dekkglassvæske. Buffer avgassing og tillegg av små surfactant mengder er vanligvis effektivt i å forebygge boble formasjon i kanalen rør og flyt. I tilfeller hvor luftbobler er introdusert til slangen, prøve å skylle bobler ut under en treg flyten og sørge for at de ikke flyter gjennom regionen der DNAs er bundet.
En strømlinjeformet og effektiv analyseprogramvare er kritisk, på grunn av den enorme mengden data som er generert. Vi samler vanligvis 700.000 høyoppløselige bilder fra målinger på en flyt cellen, som kan behandles ved hjelp av våre tilpassede enkelt partikkel sporing innen en dag på en stasjonær datamaskin med en quad-core prosessor og 32 Gb minne. Falske positive oppdage 1 D diffusjon baner av programvaren (trinn 5.5) er eksempel avhengige og kan være lav gitt at: 1) tettheten av enkelt partikler i FOV er lav nok slik at det er liten tvetydighet koble partikler på tvers av rammer ( protein prøver er generelt mer utsatt for uspesifikke adsorpsjon til dekkglassvæske enn peptid prøver, og dermed bufferen og tetthet for hvert protein sample må optimaliseres); 2) signalet til støyforhold enkelt partikler er høy nok slik at sannsynligheten for USANN-identifikasjon av partikler er lav. Likevel programvaren kan gjøre tilfeldige feil, og vi anbefaler manuell inspeksjon av dataene med den angitte GUI for å evaluere programvareytelse. I et program som er spesielt følsomme for falske positive bane gjenkjenning, kan prosessen parametere inkludert terskelverdien, minFrames, minTriplets og Chi2_stat angis mer strengt på bekostning av lavere følsomhet for ekte bindingen hendelser og potensielt større statistiske skjevhet i bane identifikasjon. Vi her deler og beskrive våre enkelt partikkel sporing med håp om å hjelpe standardisere dataanalyse metoder og stimulere diskusjonen om beste praksis.
I vår protokollen, som krever kontinuerlig under å opprettholde strukket staten av DNA mal molekyler, flytende flyt kan skjevhet transport av noen proteiner langs DNA maler hvis de diffus ved en hopper ordning eller den etter radius av merket fluorophore er store22,23. Mens slike skjevheter kan måles og korrigert i de fleste datasett, transport av proteiner merket med en liten fluorophore og spre ved en vektskivemekanisme ikke vanligvis er forutinntatt synlig grad av flyt2,4, 24. Spesielt har virkningen av er flyten hastighet på transport av proteiner langs DNA blitt brukt til å studere mekanismer for protein spre langs DNA23. A nært knyttet alternativ tilnærming som gjør at målinger i fravær av benytter DNA maler med biotin på begge termini som er transiently strukket i flyt og bundet av begge ender dekkglassvæske slik at DNA-molekyler forblir i en utvidet konfigurasjon når strømmen er slått av25,26,27,28. Dobbel-tjore tilnærming har fordelen at flyt-fri transport eksperimenter men krever endre begge ender av DNA mal molekyler, forsiktig flytkontroll under tethering og karakterisere avstanden mellom to bundet områder. I tillegg må virkningen av heterogene spenninger og DNA conformational dynamics over DNA molekyler på enkelt-molekylet analysen vurderes.
Helt, i tillegg til studere 1 D spredningen av molekyler langs DNA, som rapporterte ett molekyl analysen kan ha nytte mange i vitro biokjemiske og Biofysiske studier på ett molekyl nivå inkludert DNA målrette søkeprosess av proteiner, enzymatisk aktiviteter på DNA og mer.
Feilsøking
Problem 1: Flyt kanaler lekkasjen.
Løsning: Kontroller først at utformingen av flyt kanaler gir minst 1,5 mm margin for tetting rundt og mellom kanaler; og, under montering av flyt cellen, kontroller at kontakten overflater mellom dekkglassvæske, dobbel-teip og PDMS skive er flatt, tørt og ledig av debris, at stort trykk som brukes for å danne forseglingen er uniform, og at forsegling operasjonen er utført ved romtemperatur.
Problem 2: Tettheten av bundet DNAs er for lavt.
Løsning: Dette problemet oppstår når PINNEN functionalization effektivitet er lav eller DNA-molekyler er ikke functionalized med biotin. Fra vår erfaring, tetthet av bundet DNA bør være høy for > 90% av coverslips forberedt fra friske eller riktig lagret silane-PEG-biotin reagens. I tilfeller når tettheten av bundet DNA er lav med en bevist bakst av biotin-λ-DNA, prøve øker konsentrasjonen av silane-PEG-biotin PEG functionalization og konsentrasjoner av streptavidin og biotin-λ-DNA i DNA tethering. Hvis dette mislykkes, erstatte pinne og streptavidin reagenser.
Problem 3: DNAs holde seg til dekkglassvæske end kan strekkes av flyt.
Løsning: Dette problemet kan også oppstå når PINNEN functionalization effektivitet er lav, og er forverret av lav analysen pH. Prøv flyter i flere BSA eller heve pH (f.eks å 8.0) for å undertrykke DNA adsorpsjon til overflaten (trinn 4.3.2). Hvis DNA adsorpsjon er en vedvarende sak under en bestemt analysen tilstand, kan du prøve å inkludert opp til 90% silane-PEG-COOH under pinne functionalization.
DATA analyse notater:
Vi bruker egendefinerte enkelt partikkel sporing for å identifisere baner enkelt molekyler spre langs DNA, fra som deres 1D diffusjon konstanter, D1 estimeres. For å forbedre dataanalyse, implementert vi radial symmetri algoritmen18 for lokalisere partikler og kovariansen-baserte estimator19 for å estimere 1 D diffusjon konstanter, som dramatisk sped opp dataanalyse uten at nøyaktighet. Vi har tidligere validert av tilpasset programvare ved å analysere simulert data11. De viktigste trinnene er beskrevet nedenfor.
Partikkel identifikasjon:
Dette er for å oppdage og segmentere partikler – Diffraksjon-begrenset flekker – fra bakgrunnen. Først romlig båndpass filtrere bildene for å styrke signalet fra partikler i 3-5 piksler rekke (som tilsvarer størrelsen på spilltilbud funksjonen på vårt system) og deretter terskelen basert på intensitet (se skript: spt2_SD_sandbox.m).
Centroid tildeling
Segmentering bildet bare regionaliserer molekyler pikselnivå romlig oppløsning. For å lokalisere molekyler til mye høyere presisjon, ansette Radial symmetri super oppløsning algoritmen18 bilder filtrert som ovenfor. (Denne metoden er basert på en analytisk beregning og dermed reduserer vesentlig beregningsorientert byrden sammenlignet med populære høy nøyaktighet som 2D Gaussian montering (se skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikkel sporing:
For å spore banen til en partikkel gjennom tid, må vi å identifisere den samme partikler som de beveger seg mellom rammer. Vi anser innvielsen, blinker og oppsigelse etappene å være komponenter i en bane. Vi begrense sammenhengen av partikler i gjeldende rammer de vises i tidligere rammer ved maksimal forskyvning hver ramme. I tilfeller der flere sammenhengene er mulig Jonker-Volgenant algoritmen brukes til å gi globalt optimal sammenhengen sett (se skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1 estimering:
Hvis du vil beregne D1 verdier fra baner, bruker vi kovariansen-baserte Estimator (CVE)19. Basert på en analytisk beregning, denne metoden er mer beregningsmessig effektiv og statistisk strenge enn andre vanlige metoder som regresjon av gjennomsnittlig kvadrat forskyvninger (se skript: runspt5_SD.m).
Bane filtrering:
Noen baner inneholder gjenstander som kobling til overflaten-bundet molekyler og må fjernes. Vi implementert flere funksjoner som minimum forskyvning parallelt DNA, maksimal forskyvning tverrstilt til DNA, minimal lengden på banen, minimalt antall trilling påfølgende oppdaget posisjoner, og minimum sannsynligheten poengsum (se Xiong et al11 definisjon) som kan filtreres for å isolere et minimalt partisk antall baner sannsynlig representerer molekyler spre på DNA (se skript: sptViewFig2_update3x.m).
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick og Evangelos Gatzogiannis for hjelp med første instrumentering oppsett og testing. Vi takker ytterligere Tony Kulesa betydelig hjelp skriving og vurdere den tilpassede enkelt partikkelen sporing. Dette arbeidet ble støttet av oppstart finansiering og en Career-pris på det vitenskapelige grensesnittet (PCB) fra Burroughs Wellcome Foundation.
Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
Script programming software | MathWorks | Matlab | |
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |