Detta protokoll visar en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flöde-stretching-analys för att studera endimensionell (1D) diffusionshastighet för molekyler längs DNA.
Vi beskriver en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flöde-stretching-analys för att studera 1D diffusionshastighet för molekyler längs DNA. I denna analys, glas coverslips är functionalized i en one-step reaktion med silan-PEG-biotin. Flödesceller är uppbyggda av sandwiching en tejp med färdigskurna kanaler mellan ett functionalized täckglas och en PDMS platta innehållande inlopp och utlopp hål. Flera kanaler är integrerade i ett flöde cell och flödet av reagenser till varje kanal kan vara helt automatiserad, vilket avsevärt ökar assay genomströmning och minskar hands-on tid per analys. Inuti varje kanal, biotin-λ-DNAs är orörlig på ytan och ett laminärt flöde används för att flödet-stretch de utsedda nationella myndigheterna. DNA-molekylerna sträcks till > 80% av sin kontur längd och servera som rumsligt extended mallar för att studera aktiviteten bindande och transport av fluorescently märkta molekyler. Trajectoriesen av enstaka molekyler spåras av time-lapse totala inre reflektion fluorescens (Frida) imaging. RAW-bilder analyseras med strömlinjeformad anpassade enda partikel spårning programvara automatiskt identifiera banor av enstaka molekyler sprida längs DNA och uppskatta sin 1D diffusion konstanter.
Långvariga problem i biologi är hur endogena proteiner som agerar på specifika platser i genomet kan lokalisera deras DNA mål tillräckligt snabbt för organismen att överleva och effektivt bemöta sin omgivning. Studier under de senaste fyrtio åren föreslagit och i hög grad stöd för hypotesen att kinetiken för DNA rikta Sök genom ett protein kan påskyndas genom gjord lättare diffusion där proteinet växlar mellan 3D diffusion i bulk och 1D diffusion (inklusive glidande och hoppande processer) längs DNA1. Det är nu känt att många proteiner involverade i genreglering, nukleinsyra metabolism och andra processer klarar av glidande på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Dessutom rapporterade nyare studier att även små peptider kan binda till och skjut på DNA, med förmåga att transportera en Last. exempelvis en proteinmolekyl eller PCR primer, längs DNA10,11,12,13,14.
De senaste 15 åren, har enda molekyl flöde-stretching analysen använts allmänt att studera bindande och diffusionshastighet för molekyler längs DNA2,15,16. I denna typ av analys, immobilizeds biotinylerade dubbelsträngat DNA-molekyler på ytan och en laminär tillämpas flöde sträcka DNA. Den > 80% sträckt DNAs serve som rumsligt utökade mallar för att studera bindande och transport aktivitet av molekyler märkta med fluorophores där trajectoriesen av enstaka molekyler längs DNA spåras av time-lapse fluorescens imaging. I vårt genomförande, optimerad för reproducerbarhet och användarvänlighet, denna analys består av fem viktiga steg: beredning av biotin-λ-DNA, täckglas funktionalisering, flöde cell konstruktion, fluorescens imaging och dataanalys. I föregående protokoll17, glas coverslips var functionalized av första reagera med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) och sedan med amine-reaktivt polyetylenglykol (PEG) reagens (t.ex. NHS-PEG-biotin) att bilda en PEG-lager som motstår ospecifik adsorption av assay komponenter till täckglas ytan. Kvaliteten på functionalized coverslips berodde till stor del på kvaliteten på PEG reagenser och reaktion villkor vid varje steg. Våra protokollet beskriver en förenklad funktionalisering protokoll och multiplex flöde cell konstruktion som kräver inget flytande lim eller härdningstid i dag flöde celler är monterade. Vi beskriver också en strömlinjeformad och robust data analys förfarandet11 som eliminerar processorkrävande regression steg genom att tillämpa en radiell symmetri metod för centroiden lokalisering18 och en kovarians-baserade diffusion konstant estimator19.
Här redovisar vi en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flow stretching analysens genomförande med signifikanta förbättringar gjorts i täckglas funktionalisering, flöde cell konstruktion och analys av data. Särskilt utvecklade vi ett one-step täckglas funktionalisering protokoll, där rena torra coverslips reagerar direkt med silan-PEG-biotin. Detta protokoll förenklar täckglas beredning och förbättrar tillförlitligheten i kvaliteten på functionalized ytor jämfört med standard two-step reaktion protokollet. Vi beskriver användningen av så-functionalized coverslips med flerkanaligt PDMS flödesceller som aktiverar robust slang anslutningar göras utan lim. Dessa flödesceller ytterligare inkluderar flera datorstyrda vikar för varje flöde kammare som möjliggör automatiserad reagens flödet att minska hands-on tid under installationen och ökad assay genomströmning.
När du byter från traditionell two-step täckglas funktionalisering reaktion protokollet till en one-step reaktion protokoll, märkte vi att tillförlitligheten för täckglas funktionalisering är betydligt bättre. Eftersom den totala hands-on tid för täckglas förberedelser är mindre än trettio min, rekommenderar vi förbereda färska coverslips varje dag enda molekyl imaging planeras. För att minimera försämringen av silan-PEG-biotin, bör reagens vara aliquoted och lagras under torra N2 gas vid-20 ° C vid mottagandet. Vi använder här inte PEG molekyler som producerar -COO– eller -CH3 terminal grupper som har använts i tidigare20. De negativa laddningarna i -COO– grupper och de hydrofoba -CH3 grupperna utnyttjades för att förhindra ospecifik adsorption av DNA-molekyler och specifikt protein prover till ytan, respektive. Vi observerar mycket låg ytan adsorption av liten peptid prover på fullt biotin-avslutad PEG ytan, medan silan-PEG-COOH eller silan-PEG-CH3 kan vara användbar för analyser av vissa protein prover eller när assay villkor (såsom pH < 7,5) främja DNA-ytan interaktioner.
Övergången från glas bild flödesceller till PDMS flöde celler påskyndar flödet cell byggandet och tillåter enkel integrering av flera kanaler. Ofta skräddarsyr vi åtta kanaler per flöde cell att aktivera åtta oberoende experiment per functionalized täckglas. För att ytterligare öka genomströmning per täckglas, användas ännu större antal mikro-fabricerade kanaler.
Det är tillrådligt att förhindra luft bubbla bildandet inuti kanalen när som helst efter första påfyllning. Vanligtvis, luftbubblor orsakar inte förlust av uppbundna DNAs (även om detta är möjligt), men snarare störa flödet och möjligen orsaka DNAs att hålla sig till täckglaset. Buffert avgasning och tillägg av små tensid kvantiteter är vanligtvis effektivt för att förebygga bubbla bildandet inom slangar och flöde kanal. I fall där luftbubblor introduceras till slangen, försök att spola bubblor ut under ett långsamt flöde och se till att de inte flöda genom regionen där DNAs är uppbundna.
En strömlinjeformad och effektiv data analys programvara är avgörande, på grund av den enorma mängden data som genereras. Vi brukar samla in 700 000 högupplösta bilder från mätningar på en flöde cell, som kan bearbetas med hjälp av våra anpassade enda partikel spårning programvara inom en dag på en stationär dator med en quad-core processor och 32 Gb minne. Andelen falskt positiva upptäcka 1 D diffusion banor av programvaran (steg 5,5) är provet beroende och kan vara ganska låg med tanke på att: 1) tätheten av enstaka partiklar i FOV är tillräckligt låg så att det finns lite tvetydighet länka partiklar över () ramar protein prover i allmänhet är mer benägna att ospecifik adsorption till täckglaset än peptid prover, och således bufferten och effekttätheten för varje protein prov behöver optimeras); (2) signalen-brusförhållandet för enstaka partiklar är tillräckligt hög så att sannolikheten för falskt-identifiering av partiklar är låg. Fortfarande, programvaran kan göra enstaka misstag, och vi rekommenderar manuell inspektion av data med hjälp av den medföljande GUI för att utvärdera programvara. I ett program som är särskilt känsliga för falskt positiva bana upptäckt, kan processparametrar inklusive tröskelvärde, minFrames, minTriplets och Chi2_stat ställas in mer strikt på bekostnad av lägre känslighet för sann bindande händelser och potentiellt större statistisk bias i bana identifiering. Vi här delar och beskriva vår enda partikel spårning programvara med hopp om att hjälpa standardisera data analysmetoder och stimulera till diskussion om bästa praxis.
I våra protokoll, som kräver kontinuerligt flöde under imaging för att upprätthålla det sträckt tillståndet av DNA mall molekylerna, kunde vätskeflöden bias transport av vissa proteiner längs DNA mallar om de diffusa av en hoppande mekanismen eller om de hydrodynamiska radie av märkt fluorophore är stora22,23. Medan sådana bias kan mätas och korrigeras i de flesta DataSet, transport av proteiner märkt med en liten fluorophore och sprida av en glidande mekanismen är inte vanligtvis partisk detekterbara utsträckning av flöde2,4, 24. Särskilt, har effekterna av flödeshastigheten för transport av proteiner längs DNA använts för att studera mekanismerna för protein sprida längs DNA23. A nära relaterade alternativ metod som gör mätningar i avsaknad av flöde använder tredjeparts DNA mallar med biotin på både termini som sträcks normalnivå i flödet och uppbundna av båda ändarna till täckglaset sådan att DNA-molekylerna kvar i en utökad konfiguration när flödet är avstängd25,26,27,28. Metoden med dubbel-tether har fördelen av att flödet-fri transport experiment men kräver ändra båda ändarna av DNA mall molekylerna, noggrann flödesreglering under tjudra och karaktärisera avstånden mellan de två platserna som uppbundna. Dessutom bedömas effekterna av heterogena spänningar och DNA konfirmerande dynamics över DNA-molekyler på singel-molekyl analysen.
Alldeles, förutom att studera 1 D diffusionshastighet för molekyler längs DNA, som rapporterade enda molekyl analysen kan gynna många in vitro- biokemiska och biofysiska studier på enda molekyl nivå inklusive DNA rikta sökprocesser av proteiner, enzymatiska aktiviteter på DNA och mer.
Felsökning
Problem 1: Flöde kanaler läckan.
Lösning: Se först till att utformningen av flöde kanaler möjliggör minst 1,5 mm marginal för tätning runt och mellan kanaler; och sedan, under montering av cellen flöde, se till att kontaktytorna mellan täckglaset, den dubbel-tejpen och PDMS plattan är platt, torr och fri från skräp, att trycket för att bilda tätningen är enhetlig, och att försegla driften är utförs vid rumstemperatur.
Problem 2: Tätheten av uppbundna DNAs är för låg.
Lösning: Det här problemet uppstår när PEG funktionalisering effektivitet är låg eller DNA-molekylerna är inte functionalized med biotin. Från vår erfarenhet, tätheten av uppbundna DNA bör vara hög för > 90% av coverslips tillagas av färska eller korrekt lagrad silan-PEG-biotin reagens. I fall när tätheten av uppbundna DNA är låg med ett beprövat parti av biotin-λ-DNA, försöka öka koncentrationerna av silan-PEG-biotin under PEG funktionalisering och koncentrationer av streptividin och biotin-λ-DNA under DNA tjudra. Om detta misslyckas, ersätta de PEG och streptividin reagenserna.
Problem 3: DNAs hålla sig till täckglaset end kan inte sträckas av flöde.
Lösning: Problemet kan också uppstå när PEG funktionalisering effektivitet är låg, och förvärras av låg assay pH. Försök flyter i mer BSA eller höja pH (t.ex till 8,0) för att hjälpa undertrycka DNA adsorption till ytan (steg 4.3.2). Om DNA adsorption är ett ihållande problem under ett särskilt test tillstånd, prova inklusive upp till 90% silan-PEG-COOH under PEG funktionalisering.
DATA analys anteckningar:
Vi använder anpassade enda partikel spårningsprogram för att identifiera banor av enstaka molekyler sprida längs DNA, från som sin 1D diffusion konstanter, D1 beräknas. För att förbättra dataanalys, genomfört vi de radiell symmetri algoritm18 för lokalisering av partiklar och kovarians-baserade estimator19 för att uppskatta 1 D diffusion konstanter, som dramatiskt påskyndas dataanalys utan att kompromissa med noggrannhet. Vi har tidigare validerat anpassade programvaran genom att analysera simulerade data11. De stora stegen beskrivs nedan.
Partikel-identifiering:
Detta steg är för att upptäcka och segmentera partiklar – diffraktion begränsad ställen – från bakgrunden. Först, rumsligt band-pass filtrera bilderna att förbättra signalen av partiklar i 3-5 pixel intervallet (som motsvarar storleken på funktionen point-spread på vårt system) och sedan tröskelvärdet baserat på intensitet (se skript: spt2_SD_sandbox.m).
Centroiden tilldelning
Segmentera bilden endast lokaliserar molekyler till pixel-nivå rumslig upplösning. För att lokalisera molekyler till mycket högre precision, anställa radiell symmetri super upplösning algoritm18 bilder filtreras som ovan. (Denna metod bygger på en analytisk beräkning och därmed kraftigt minskar computational börda jämfört med andra populära hög noggrannhet metoder såsom 2D Gaussisk montering (se skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikel spårning:
För att spåra banan för en partikel genom tiden, måste vi identifiera samma partiklarna igen när de flyttar mellan ramar. Vi anser att de inledande, blinkar och uppsägning stadierna vara delar av en bana. Vi begränsa sammanlänkningen av partiklar i nuvarande ramar som visas i föregående bildrutor genom att den maximala förskjutningen som tillåts per bildruta. I fall där flera kopplingar är möjliga, Jonker-Volgenant algoritm används för att ge globalt optimal koppling uppsättningar (se skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1 uppskattning:
För att uppskatta D1 värden från banor, använder vi kovarians-baserade Estimator (CVE)19. Baserat på en analytisk beräkning, denna metod är mer beräkningsmässigt effektiv och statistiskt rigorösa än andra vanligt förekommande metoder såsom regression av genomsnittliga kvadrerade förskjutningar (se skript: runspt5_SD.m).
Banan filtrering:
Vissa banor innehåller artefakter såsom länkning till ytan-bundna molekyler och måste tas bort. Vi har genomfört flera funktioner såsom minsta förskjutning parallellt med DNA, maximala förskjutningen transverse till DNA, minimala längden på banan, minimalt antal triplett i följd upptäckt positioner och lägsta sannolikhet Poäng (se Xiong et al11 för definition) som kan filtreras för att isolera en minimalt partisk uppsättning banor sannolikt att representera molekyler sprida på DNA (se skript: sptViewFig2_update3x.m).
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick och Evangelos Gatzogiannis för hjälp med inledande instrumentation installation och testning. Vi tackar ytterligare Tony Kulesa för betydande hjälp skriva och utvärdera anpassade enda partikeln spårning programvara. Detta arbete stöds av start finansiering och en karriär Award på vetenskapliga gränssnittet (PCB) från Burroughs Wellcome Foundation.
Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
Bandpass filter | Semrock | FF560/659-Di01-25×36 | |
532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
Script programming software | MathWorks | Matlab | |
* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |