מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
לוקליזציה של גנים קולטן Odorant ב אנטנות ארבה על ידי RNA
במאמר זה
סיכום
תקציר
חרקים פיתחו מערכות מתוחכמות של קליטת חוש הריח לחוש אותות כימיים אקסוגניים. אלה האותות הכימיים הם transduced על ידי נוירונים קולטן חוש הריח (ORNs) שוכנים במבנים דמויי שיער, המכונה chemosensilla, של האנטנות. על קרום של ORN, Odorant קולטנים (ORs) הם האמינו להיות מעורב ריחוף ריח. לפיכך, היכולת לזהות גנים הממוקמים ל- ORN נחוצה כדי לזהות גנים, ומספקת בסיס יסודי לתפקוד תפקודי נוסף באתרו . רמות ביטוי RNA של ספציפיים או S אנטנות חרקים הם נמוכים מאוד, ושימור רקמות חרקים עבור היסטולוגיה מאתגרת. לכן, קשה למקם OR לסוג מסוים של sensilla באמצעות RNA ב הכלאה באתרו . במאמר זה, רנ"א מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו במיוחד עבור גנים לידי ביטוי נמוך של חרקים, הוא הציג. בנוסף, או ספציפי גןS זוהה על ידי ביצוע ניאון פעמיים צבע ניסויי הכלאה באתרו באמצעות שיתוף קולטן ביטוי קולטן, אורקו , כסמן.
מבוא
אנטנות חרקים, שהן האיברים הכימוזנריים החשובים ביותר, מכוסים במבנים רבים דמויי שיער - הנקראים סנסיליה - המושרשים על ידי נוירונים של קולטן חוש הריח (ORN). על הממברנה של חרקים ORN, רצפטורים אודורנט (ORs), סוג של חלבון המכיל שבעה תחומים transmembrane, באים לידי ביטוי עם corceptor (ORCO) כדי ליצור heteromer המתפקד כמו ערוץ יון מלוטש יון 1 , 2 , 3 . ORs שונים מגיבים לשילובים שונים של חומרים כימיים 4 , 5 , 6 .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כדי להגביל השפלה RNA, להכין פתרונות באמצעות מים מזוקקים רטוב autoclaved (ב 121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות) וגם חומרים אוטוקלאב רטוב.
1. הכנת RNA ISH Antisense והרגשות בדיקה
- המטרה הגברה הגן וטיהור
- ראשית, לייצר קטע BP 387 כפול stranded של L. Migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) מן הפלסמיד המכיל את cDNA באורך מלא של LmigOR1 עם פו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עם זיהוי כרומוגני, תת קבוצה קטנה של תאים antennal בכל סעיף antennal המבוגר היה מסומן על ידי DIG שכותרתו LmigOR1 ו Lmigor2 בדיקות antisense ( איור 3 ). RNA על מקטעים רצופים כדי למקם LmigOR1 ו LmigOR2 הראה כי תאים אנטנלים המבטאים את שני הגנים היו ממוקמים באשכולות ORN להביע Lmigorco , המציין כי LmigOR1 ו LmigOR2 משוערים היו למעשה ליד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זה קשה לבצע RNA ISH כדי למקם או גנים אנטנות חרקים בגלל רמות ביטוי של גנים או, למעט ORCO , הם נמוכים מאוד ושמירה פרוסות היסטולוגית של אנטנות חרקים קשה מאוד. בנוסף, זיהוי TSA הוא גם מאוד מסובך. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנקוט בצעדים הבאים. האנטנות נבחרות מתוך ארבה מבוגר החדש שיש להם עור רזה רך cuticles, אשר לשמור על המורפולוגיה שלהם על השקופית. הדגימות קפואים הם מחולקים לתוך 12 פרוסות עבה מיקרומטר. נעשה שימוש בבדיקות ביוטין ובדיג שכותרתו במיוחד. דטרגנטים, כגון Tween-20 ו- Tri.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים אחרים.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.31472037). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואין פירושו המלצה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים | |||
| 2 פעמים; TSINGKETM מאסטר מיקס | TSINGKE, סין | TSE004 | |
| ללא RNase H2O | TIANGEN, סין | RT121-02 | |
| אגרוז רגיל G-10 | BIOWEST, ספרד | 91622 | |
| מאגר מחייב | TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סין | DP209-02 | |
| מאגר איזון | TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGENסין | DP209-02 | |
| פתרון כביסה | TIANgel ערכת טיהור מידי, TIANGEN, סין | DP209-02 | |
| T וקטור | פרומגה, ארה"ב | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, ארה"ב | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, סין | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, ארה"ב | A-6140 | |
| איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, ארה"ב | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, סין | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, ניו אינגלנד | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, ניו אינגלנד | RNA R0133M | |
| DIG | רוש, שוויץ | ערכת | |
| ביוטין רוש, שוויץ | ערכת | תיוג | |
| DNase | DIG, רוש, שוויץ | 11175025910 | |
| LiCl | סינופארם, סין | 10012718 | |
| אתנול | סינופארם, סין | 10009257 | |
| חומצה אצטית | בייג'ינג כימיקל ריג'נטס חברה, סין | 10000292 | |
| רקמות-טק O.C.T. תרכובת | סאקורה פינטק אירופה, Zoeterwoude, הולנד | 4583 | |
| שקופיות | טינה ג'ין האו יאנג ייצור ביולוגי ושות', LTE, סין | FISH0010 | |
| HCl | סינופארם, סין | 80070591 | |
| Millex | Millipore, ארה"ב | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, ארה"ב | 0777-500ML | |
| Nitroblue טטרזוליום כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate מלח טולואידין | רוש, שוויץ | 11175041910 | |
| גליצרול | סינופארם, סין | 10010618 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>תגובות |
| ><חזק>פתרונות | |||
| 1&פעמים; Tris-acetate-EDTA | Sigma, ארה"ב | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1& פעמים; Tris-acetate-EDTA חברת | ריג'נטס כימית בייג'ינג, סין | 10000292 | 0.12% חומצה אצטית |
| 1& פעמים; Tris-acetate-EDTA | Sigma, ארה"ב | 03677 | חומצה אתילנדיאמינטטראצטית מלח דיסודיום (EDTA) |
| מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB) | סינופארם, סין | 10019392 10 גרם/ליטר | |
| NaCl מדיום נוזלי לוריא-ברטאני (LB) | MERCK, גרמניה | VM335231 | 10 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון) |
| מדיום נוזלי לוריא-ברטני (LB) | MERCK, גרמניה | VM361526 | 5 גרם/ליטר תמצית שמרים |
| צלחת מצע מוצק LB | סינופארם, סין | 10019392 | 10 גרם/ליטר NaCl |
| LB צלחת מצע מוצק | MERCK, גרמניה | VM335231 | 10 גרם/ליטר פפטון מקזאין (טריפטון) |
| צלחת מצע מוצק LB | MERCK, גרמניה | VM361526 | 5 גרם/ליטר תמצית שמרים |
| צלחת מצע מוצק LB | WISENT ING, קנדה | 800-010-CG | 15 גרם/ליטר אגר כיתה בקטריולוגית |
| 10 פעמים; תמיסת מלח חומצית פוספט (PBS, pH 7.1) | סינופארם, סין | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10& פעמים; תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.1) | סיגמא, ארה"ב | V900041-500G | 14 מ"מ KH<תת>2PO4 |
| 10& פעמים; תמיסת מלח חומצה פוספט (PBS, pH 7.1) | סיגמא, ארה"ב | V900268-500G | 80 מ"מ Na2HPO4 |
| 10 פעמים; תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5) | סיגמא, ארה"ב | V900483-1 ק"ג | 1 מ' Tris-Base |
| 10× תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS, pH 7.5) | סינופארם, סין | 10019392 | 1.5 מ' |
| מאגר זיהוי NaCl (DAP) זיהוי כרומוגני pH 9.5 זיהוי TSA pH 8.0 | סיגמא, ארה"ב | V900483-1KG | 100 מ"מ מאגר זיהוי Tris-Base |
| (DAP) זיהוי כרומוגני pH 9.5 זיהוי TSA pH 8.0 | סינופארם, סין | 10019392 | 100 מ"מ |
| מאגר זיהוי NaCl (DAP) זיהוי כרומוגני pH 9.5 זיהוי TSA pH 8.0 | סיגמא, ארה"ב | V900020-500G | 50 מ"מ MgCl2· 6 שעות<תת>2O |
| 20&פעמים; מי מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0) | סינופארם, סין | 10019392 | 3 מ' NaCl |
| 20&; תמיסת מלח-נתרן ציטראט (pH 7.0) | סיגמא, ארה"ב | V900095-500 גרם | 0.3 מ' Na-ציטראט |
| 4% תמיסת פרפורמלדהיד (PFA, pH 9.5) | סיגמא, ארה"ב | V900894-100 גרם | 4% מאגר |
| נתרן קרבונט | סיגמא, ארה"ב | V900182-500 גרם | 0.1 מ' NaHCO<תת>3מאגר |
| נתרן קרבונט (pH 10.2) | סיגמא, ארה"ב | V900182-500G | 80 מ"מ NaHCO3 |
| נתרן קרבונט בופר (pH 10.2) | סיגמא, ארה"ב | S7795-500G | 120 מ"מ Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, ארה"ב | FORMD002 | 50% תמיסת פורממיד פורממיד נטולת יונים |
| (pH 10.2) | 5& פעמים; מאגר חסימת מלח-נתרן ציטראט | ||
| ב-TBS | רוש, שוויץ | 11175041910 | 1% |
| מאגר חסימת כתמים ב-TBS | אמרסקו, ארה" | 0694-500 מ"ל | 0.03% טריטון X-100 |
| מאגר חוסם ב-TBS | 1& פעמים; תמיסת מלח חוצצת | ||
| Tris תמיסת פוספטאז אלקליין | רוש, שוויץ | 11175041910 1.5 U/mL נוגדן מצומד אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין | |
| תמיסת | פוספטאז אלקליין חוסם חוצץ ב-TBS | ||
| תמיסת פוספטאז אלקליין / צנון סוסים | רוש, שוויץ | 11175041910 | 1.5 U/mL אנטי דיגוקסיגנין פוספטאז אלקליין מצומד נוגדן |
| אלקליין פוספטאז / תמיסת פרוקסידאז צנון סוסים | ערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"ב | NEL701A001KT 1% אנטי ביוטין סטרפטווידין צנון סוסים פרוקסידאז - נוגדן מצומד | |
| פוספטאז אלקליין / תמיסת | חוסם מאגר ב-TBS | ||
| מאגר הכלאה | MPBIO, ארה"ב | FORMD002 | 50% היברידיזציה של פורממיד דה-יונים |
| חוצץ | פעמיים; | ||
| מאגר היברידיזציה | סיגמא, ארה"ב | D8906-50G | 10% דקסטרן סולפט |
| מאגר הכלאה | invitrogen, ארה"ב | AM7119 | 20 ומיקרו; גרם/מ"ל שמרי t-RNA |
| מאגר היברידיזציה | סיגמא, ארה"ב | D3159-10G | 0.2 מ"ג/מ"ל זרע הרינג DNA |
| 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלח | רוש, שוויץ | 11758888001 | 1% 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט (10 מ"ג/מ"ל) |
| 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילאניליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע מלח | רוש, שוויץ | 11758888001 | 1% 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מלח (25 מ"ג/מ"ל) |
| 2-הידרוקסי-3-חומצה נפטואית-2'-פנילנליד פוספט/ 4-כלורו-2-מתילבנזנדיאזוניום המי-אבץ כלוריד מצע | זיהוי אות | ||
| טירמיד ערכת TSA מצע הגברה | פרקין אלמר, ארה"ב | NEL701A001KT | 2% פלואורסצאין-טירמידים |
| מצע הגברת אות טירמיד | ערכת TSA, פרקין אלמר, ארה"ב | NEL701A001KT | מדלל |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>מכשיר | |||
| מקפיא מיקרוטום | לייקה, נוסלוך, גרמניה | Jung CM300 קריוסטט ספקטרופוטומטר | |
| תרמו מדעי, ארה"ב | NANODROP 2000 | ||
| מיקרוסקופ אופטי | אולימפוס, טוקיו, יפן | אולימפוס IX71מיקרוסקופ | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | אולימפוס, טוקיו, יפן | אולימפוס BX45 מיקרוסקופ |
מקורות
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven trans....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
