א<em> Caenorhabditis elegans</em> מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion
Summary
כאן, אנו מציגים assay Caenorhabditis elegans- Specific שנועד להעריך שינויים התנהגות הנטייה נחושת ואת היכולת לאתר מקור מזון משותף, כמו האורגניזם מתקדמת ממצב תזונה רעב עד כדי רעב.
Abstract
כדי להבטיח הישרדות, אורגניזמים חייבים להיות מסוגלים להימנע בתי גידול שלילי תוך הבטחת מקור מזון עקבי. Caenorhabditis elegans לשנות את דפוסי locomotory שלהם על זיהוי של גירויים סביבתיים שונים והוא יכול לווסת את חבילת תגובות התנהגותיות בתגובה לתנאי רעב. נמטודות בדרך כלל התערוכה תגובה מרתיעה ירידה כאשר הוסרו ממקור מזון במשך 30 דקות. התבוננות בשינויים התנהגותיים בתגובה למעמד תזונתי משתנה יכולה לספק תובנה לגבי המנגנונים המסדירים את המעבר ממצב של רעב עד רעב.
פיתחנו assay אשר מודד יכולת של נמטודות לעבור מחסום מרתיע ( כלומר נחושת) ואז להגיע למקור מזון על פני תקופה ממושכת של זמן. פרוטוקול זה בונה על עבודה קודמת על ידי שילוב משתנים מרובים באופן המאפשר איסוף נתונים המשיך כמו האורגניזמים לנוע לעברמצב יותר ויותר מורעב. יתר על כן, assay זה מאפשר הגדלת גודל המדגם, כך אוכלוסיות גדולות יותר של נמטודות ניתן להעריך בו זמנית.
אורגניזמים פגומים ביכולת לזהות או להגיב לנחושת מיד לחצות את המכשול הכימי, בעוד נמטודות סוג בר בתחילה דחו. כמו תולעים סוג בר הם יותר ויותר מורעבים, הם מתחילים לחצות את המכשול ולהגיע למקור המזון. עיצבנו assay זה כדי להעריך מוטציה כי הוא מסוגל להגיב על רמזים סביבתיים מגוונים, כולל תחושת מזון או זיהוי של כימיקלים מרתיעה. כאשר מוערכים באמצעות פרוטוקול זה, אורגניזמים פגומים מיד חצה את המכשול, אבל גם לא היו מסוגלים לאתר מקור מזון. לפיכך, מוטציות אלה שוב ושוב לחצות את המכשול הכימי למרות להגיע באופן זמני למקור מזון. Assay זה יכול בקלות לבדוק אוכלוסיות של תולעים להעריך פגמים פוטנציאליים המסלול הקשורים סלידה והרעב.
Introduction
Caenorhabditis elegans שימש מודל לחקר הנוירוביולוגיה במשך עשרות שנים בשל הקלות היחסית בניתוח המעגל של מערכת העצבים המורכבת רק 302 נוירונים 1 . בתנאי שהאורגניזם מסתמך על תגובה לרמזים סביבתיים, חלק גדול ממערכת העצבים מוקדש לוויסות השילוב של אותות סביבתיים 2 . למרות הפשטות של מערכת העצבים שלה, C. elegans יכול לזהות ולהגיב על אותות סביבתיים מגוונים כולל repellents 3 , 4 , 5 טמפרטורות 5 , ואפילו לחות 6 . כישלון לשלב אותות סביבתיים כמו שצריך נקשר מספר הפרעות התנהגותיות תנאים ניווניות במערכות מודל יונקים 7- 9. עם מגוון של מודלים של מחלות עצביות זמינות 10 ב C. elegans ופיתוח של nematode מסכי התרופות 11 , אורגניזם זה הוכיח להיות מערכת שימושית לחקר נוירוביולוגיה. בהתחשב בזמינות של מיפוי nematode connectome 1 ומוטציות כמעט כל גן בגנום nematode 12 , ההבנה שלנו של מערכת העצבים nematode, ועל ידי הארכה שלנו, מוגבל חלקית על ידי העיצוב של מבחני המתאים מבחינה יצירתית.
מספר מבחני chemotaxis פותחו במהלך 40 השנים האחרונות כדי להעריך היענות nematode לגירויים מגוונים שונים 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . הניסוי הראשוני כלל את ההקדמה של גירוי סביבתי חריף בעוד תולעת בודדת משוטטת על צלחת אגר= "Xref"> 3 , 14 , 16 . נרשמו שינויים מיידיים בתגובות קטריות. לדוגמה, octorol ריחניים נדיפים ניתן להחיל על השיער ו wafted מול האף nematode כדי לעורר את החניכה של תנועה לאחור בתולעים סוג בר 17 . מבחנים מורכבים יותר פותחו גם כדי לשלב משתנים מרובים כאמצעי להערכת בחירה התנהגותית 18 . וריאציה של assay זה כרוך בשימוש של פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע 4 . אטרקציה, כלומר דיאכטיל, הונחה על צד אחד של המכשול הכימי עם תולעים שהועברו ממקור הדיאצטיל. תולעים פגומות לתגובות נחושת נחפזות חצו מיד את המכשול כדי להגיע לדיאצטיל, בעוד שתולעים מסוג בר נדחקו בתחילה על ידי המכשול. התגובות נצבעו כאשר התולעים התקרבו לראשונה למחסום הנחושתללא תצפיות לטווח ארוך.
כאשר תולעים מוערכים לאחר עוברים תנאי רעב, הרגישות שלהם לגירויים סביבתיים הוא ירד 19 . כאשר octanol כימית מרתיעה הוא wfted מול האף nematode, אורגניזמים סוג בר לעורר תנועה לאחור בתוך 3 – 5 s כאשר על מזון. לאחר אורגניזמים אלה הוסרו מן המזון במשך 10 דקות, הם מפגינים תגובה מאוחרת של 8 – 10 s 20 . לכן, עם רעב מוגבר, נמטודות להציג תגובה מרתיעה מופחתת אותות סביבתיים מזיקים כמו החיפוש אחר מזון הופך חיוני יותר להישרדות. לעומת זאת, נמטודות כי over-express קולטן neuropeptide 9 ( npr-9) , לא מגיבים אוקטנול על או ביטול מזון ולהציג חוסר היכולת להגיב על מספר גירויים מרתיעה 21 . אלה npr-9 (GF) אורגניזמים גם לא לשנות את תדירות היפוך שלהם בנוכחות מזון, אבל יכולהפוך בתגובה לגירויים מגע קשים המציין כי הם מסוגלים תנועה לאחור 21 . יש לנו גם העריכו npr-9 (LF) מוטציות בהתחשב בכך שהם מפגינים תדירות היפוך ירד באופן חריג את האוכל עדיין יכול לווסת את התנהגותם בנוכחות מזון 21 . צימוד המצב התזונתי של התולעת עם ההקדמה של גירויים חיצוניים חריפים סייעה בבירור המנגנונים שבאמצעותם מסלול הקשור למזון יכול לשנות את מסלולי האיתות החושי 22 , 23 . הנוכחות של מזון בסביבה נמטודות שימש גם כדי להעריך תגובות אתנול הנסיגה 24 . בניסוי זה, תולעים הודגרו בריכוזים שונים של אתנול ולאחר מכן הונחו על צלחת אגר עם כתם של מזון המכונה "assay גזע מזון". תיקון המזון הונח על קצה אחד של הצלחת בעוד נמטודות wEre הניח ממקור המזון. נסיגה אתנול הוערך על ידי מדידת משך הזמן הנדרש עבור תולעים להגיע חתיכת מזון.
זה מבוסס תזונת נחושת assay מבוסס בונה על assay גזע מזון לשלב משתנים סביבתיים נוספים, כלומר מזון ונחושת, תוך הערכת שינויים התנהגותיים לאורך זמן. זוהי הסתגלות של פרוטוקול שימוש נפוץ ברחבי הקהילה elegans C. 4 . פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי להעריך תגובות מרתיעה ואיתור מזון על פני תקופה של ארבע שעות 21 . מאז התולעת של התנהגויות רעב התערוכה לאחר 30 דקות של מניעת מזון 25 , אנחנו גם מסוגלים להעריך כיצד שינויים במצב התזונתי יכול להשפיע על תגובות סביבתיות. התנאים של assay זה למדוד כיצד אורגניזמים ניסיוני לשנות את התגובה לגירויים מרתיעה לאורך זמן, ומכאן זה מעריך שינויים התנהגותיים כמואורגניזמים מתקדמים לעבר מדינה מורעבת (והמשיכו מדידות של רעב ממושך). מאחר שחיות ה- NF-9 (GF) אינן משנות את התנהגותן בתגובה לאוכל או לרמזים מרתיעים רבים, ביקשנו לזהות אם הגירעונות ההתנהגותיים הללו ימשיכו להתקיים בהקשר של רעב. בסופו של דבר, זה עיצוב assay כבר ניסח במיוחד כדי להעריך את npr-9 (GF) מוטציות אבל יכול להיות מותאם נוספת גם לאפיין זנים חדשניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עיצוב assay זה משנה את assay גזע מזון 24 לכלול פתרון נחושת כדי ליצור מחסום midline מרתיע סביב קצה הצלחת כדי למנוע אובדן של נמטודות. אורגניזמים נבדקים על יכולתם לחצות את מחסום מרתיע ולהגיע תיקון מזון על פני 4 שעות. בהקשר של npr-9 (GF) , יש לנו ניצלו assay זה כדי להעריך כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה גילוי מענק RGPIN36481-08 כדי ויליאם ג 'בנדנה.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
