en<em> Caenorhabditis elegans</em> Nutritionell statusbaserad koppar-aversionsanalys
Summary
Här presenterar vi en Caenorhabditis elegans- specifik analys som är utformad för att utvärdera förändringar i kopparavvikande beteende och möjligheten att lokalisera en gemensam matkälla, då organismen fortskrider från ett välmatat till svältnäringstillstånd.
Abstract
För att säkerställa överlevnad måste organismer kunna undanröja ogynnsamma livsmiljöer samtidigt som man säkerställer en konsekvent livsmedelskälla. Caenorhabditis elegans förändrar deras rörelsesmönster vid upptäckt av olika miljöstimuli och kan modulera sin svit av beteendemässiga svar som svar på svältförhållanden. Nematoder uppvisar vanligen ett minskat aversivt svar när de avlägsnas från en matkälla i över 30 minuter. Observation av beteendemässiga förändringar som svar på en förändrad näringsstatus kan ge insikt i de mekanismer som reglerar övergången från ett välmatat till svältat tillstånd.
Vi har utvecklat en analys som mäter en nematods förmåga att korsa en aversiv barriär ( dvs. koppar) och nå en matkälla över en längre tidsperiod. Detta protokoll bygger på tidigare arbete genom att integrera flera variabler på ett sätt som möjliggör fortsatt datainsamling när organismerna flyttar mot aN alltmer hungrig tillstånd. Dessutom tillåter denna analys en ökad provstorlek så att större populationer av nematoder kan utvärderas samtidigt.
Organ som är defekta för förmågan att upptäcka eller reagera på koppar korsar genast kemikaliebarriären, medan vildtypsmetatoder avstängs från början. När vildtypsmaskar i allt högre grad sväljs börjar de korsa barriären och nå matkällan. Vi utformade denna analys för att utvärdera en mutant som inte kan reagera på olika miljöanvisningar, inklusive matavkänning eller upptäckt av aversiva kemikalier. När det utvärderades via detta protokoll, gick de defekta organismerna genast över barriären, men kunde inte heller detektera en matkälla. Följaktligen korsar dessa mutanter upprepade gånger den kemiska barriären trots att de tillfälligt når en matkälla. Denna analys kan enkelt testa populationer av maskar för att utvärdera potentiella vägarfel relaterade till aversion och svält.
Introduction
Caenorhabditis elegans har använts som en modell för studier av neurobiologi i årtionden på grund av den relativa lättheten vid analys av kretsen i ett nervsystem som består av endast 302 neuroner 1 . Under förutsättning att organismen är beroende av att reagera på miljöanvisningar, är mycket av nervsystemet dedikerat till att reglera integrationen av miljösignaler 2 . Trots enkelheten i nervsystemet kan C. elegans detektera och reagera på olika miljösignaler, inklusive repellenter 3 , dragmedel 4 , temperatur 5 och jämn fuktighet 6 . Ett misslyckande att korrekt integrera miljösignaler har kopplats till ett antal beteendestörningar och neurodegenerativa tillstånd i däggdjursmodellsystem 7- 9. Med en rad tillgängliga neurala sjukdomsmodeller 10 i C. elegans och utvecklingen av nematod-farmaceutiska skärmar 11 har denna organism visat sig vara ett användbart system för studier av neurobiologi. Med tanke på tillgängligheten av en mappad nematod-anslutning 1 och mutationer till nästan varje gen i nematodgenomet 12 , är vår förståelse av nematodnervsystemet, och i förlängning vår egen, delvis begränsad av utformningen av kreativt lämpliga analyser.
Ett antal kemotaxisanalyser har utvecklats under de senaste 40 åren för att utvärdera nematoderresponsen för olika aversiva stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . Initiala experiment involverade införandet av en akut miljöstimulans medan en enda mask sneglade på en agarplatta= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Omedelbara förändringar av lokomotivsvar registrerades. Till exempel kan den flyktiga luktande oktanolen appliceras på ett hår och wafted framför en nematods näsa för att stimulera initieringen av bakåtriktningen i vildtypsmaskor 17 . Mer komplexa analyser har också utvecklats för att införliva flera variabler som ett sätt att bedöma beteendemässigt val 18 . En variation av denna analys medför användning av en kopparlösning för att skapa en aversiv midterbarriär 4 . Ett attraktivt medel, nämligen diacetyl, placerades på ena sidan av det kemiska barriäret med maskar överförda från diacetylkällan. Ormar som är defekta för kopparavvikande responser korsade genast barriären för att nå diacetylen, medan vildtypsmaskar ursprungligen avstöttes av barriären. Svaren gjordes när maskarna först närmade sig kopparbarriärenUtan långsiktiga observationer.
När maskar utvärderas efter svältförhållanden minskar deras känslighet för miljöpåverkan 19 . När den aversiva kemiska oktanolen blåses framför nematodnäsan, stimulerar vildtypsorganismer bakåtgående rörelse inom 3 – 5 s när de är på mat. Efter det att dessa organismer har avlägsnats från mat i 10 minuter uppvisar de ett fördröjt svar på 8 – 10 s 20 . Således med ökad svält visar nematoder ett minskat aversivt svar på skadliga miljösignaler, eftersom sökandet efter mat blir mer viktigt för överlevnad. Omvänt svarar inte nematoder som överuttrycker neuropeptidreceptorn 9 ( npr-9) på oktanol på eller av mat och uppvisar en oförmåga att reagera på ett antal aversiva stimuli 21 . Dessa npr-9 (GF) organismer modulerar inte heller sin reverseringsfrekvens i närvaro av mat, men kanOmvänd som svar på hårda beröringsstimuleringar som indikerar att de kan bakåtlöpning 21 . Vi har också utvärderat npr-9 (LF) -mutanter med tanke på att de uppvisar en onormalt minskad omkörningsfrekvens från mat men ändå kan modulera sitt beteende i närvaro av mat 21 . Koppling av näringstillståndet hos masken med införandet av akuta yttre stimuli har hjälpt till att belysa mekanismerna genom vilka en matrelaterad väg kan breddmodulera sensoriska signalvägar 22 , 23 . Närvaron av livsmedel i nematodmiljön har också använts för att utvärdera etanolavtagningsreaktioner 24 . I detta experiment inkuberades maskar i varierande koncentrationer av etanol och placerades sedan på en agarplatta med en fläck mat som var känd som en "matrasanalys". Maten lappar placerades på ena sidan av plattan medan nematoderna wÄr placerade bort från matkällan. Etanoluttagning utvärderades genom mätning av den tid som krävdes för maskar för att nå livsmedelsklassen.
Denna näringsbaserade kopparavläsningsanalys bygger på mat-rasanalysen för att integrera ytterligare miljövariabler, nämligen mat och koppar, samtidigt som man bedömer beteendeförändringar över tid. Detta är en anpassning av ett gemensamt användningsprotokoll i hela C. elegans community 4 . Detta protokoll har använts för att utvärdera aversiva svar och detektering av mat över en fyra timmarsperiod 21 . Eftersom maskens uppvisar svältbeteenden efter 30 minuter av matbrist 25 kan vi också utvärdera hur förändringar i näringsstatus kan påverka miljöpåverkan. Villkoren för denna analys mäter hur experimentella organismer förändrar responsen till aversiva stimuli över tid, och det utvärderar därför beteendeförändringar somOrganismer framsteg mot ett svält tillstånd (och fortsatta mätningar av långvarig svält). Eftersom npr-9 (GF) djuren inte ändrar sitt beteende som svar på mat eller många aversiva signaler, försökte vi identifiera om dessa beteendeunderskott skulle bestå i samband med svält. I slutändan har denna analysdesign utformats för att specifikt utvärdera npr-9 (GF) -mutanterna men kan vidare anpassas för att också karakterisera nya stammar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna analysdesign modifierar matrasanalysen 24 för att inkludera en kopparlösning för att skapa en aversiv mittlinjebarriär och runt kanten av plåten för att förhindra förlust av nematoder. Organismer testas för deras förmåga att korsa den aversiva barriären och nå en matplast över en 4 h period. I samband med npr-9 (GF) har vi använt denna analys för att utvärdera hur svältförhållandena kan påverka aversiva svar och detektering av mat. Förutsatt att vi ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet för Kanada Discovery Grant RGPIN36481-08 till William G. Bendena.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
