EN<em> Caenorhabditis elegans</em> Næringsstatusbaseret kobber Aversion Assay
Summary
Her præsenterer vi en Caenorhabditis elegans -specifik analyse designet til at evaluere ændringer i kobberaversionsadfærd og evnen til at lokalisere en fælles fødevarekilde, da organismen udvikler sig fra en velfødt til sultet næringsstatus.
Abstract
For at sikre overlevelse skal organismer være i stand til at undgå ugunstige levesteder samtidig med at der sikres en konsekvent fødekilde. Caenorhabditis elegans ændrer deres bevægelsesmønstre ved påvisning af forskellige miljømæssige stimuli og kan modulere deres pakke af adfærdsmæssige reaktioner som reaktion på sultbetingelser. Nematoder udviser typisk et nedsat aversivt respons, når de fjernes fra en fødekilde i over 30 minutter. Observation af adfærdsændringer som reaktion på en ændret ernæringsstatus kan give indsigt i de mekanismer, der regulerer overgangen fra en velfødt til sultet tilstand.
Vi har udviklet et assay, der måler en nematode evne til at krydse en aversive barriere ( dvs. kobber) og nå en fødekilde over en længere periode. Denne protokol bygger på tidligere arbejde ved at integrere flere variabler på en måde, der muliggør fortsat dataindsamling, når organismerne skifter mod aN mere sultet tilstand. Desuden tillader dette assay en forøget prøvestørrelse, således at større populationer af nematoder kan evalueres samtidigt.
Organer, der er defekte for evnen til at detektere eller reagere på kobber, krydser straks den kemiske barriere, mens vildtype nematoder i starten afstødes. Efterhånden som vildtype orme bliver mere og mere sultede, begynder de at krydse barrieren og nå fødekilden. Vi har udformet dette assay for at evaluere en mutant, der ikke er i stand til at reagere på forskellige miljømæssige tegn, herunder madfølelse eller påvisning af aversive kemikalier. Ved evaluering via denne protokol krydsede de defekte organismer straks barrieren, men var heller ikke ude af stand til at detektere en fødekilde. Derfor krydser disse mutanter gentagne gange den kemiske barriere, selv om de midlertidigt når en fødevarekilde. Dette assay kan let teste populationer af orme for at evaluere potentielle vejfejl i forbindelse med aversion og sult.
Introduction
Caenorhabditis elegans er blevet anvendt som model for undersøgelsen af neurobiologi i årtier på grund af den relative lethed ved at analysere kredsløbene i et nervesystem bestående af kun 302 neuroner 1 . Forudsat at organismen er afhængig af at reagere på miljøet, er meget af nervesystemet dedikeret til at regulere integrationen af miljøsignaler 2 . På trods af enkelhed i nervesystemet kan C. elegans detektere og reagere på forskellige miljøsignaler, herunder repellenter 3 , attractants 4 , temperatur 5 og endda fugtighed 6 . En manglende korrekt integrere miljømæssige signaler er blevet forbundet med en række adfærdsmæssige lidelser og neurodegenerative tilstande i mammale modelsystemer 7- 9. Med en række tilgængelige neurale sygdomsmodeller 10 i C. elegans og udviklingen af nematode farmaceutiske skærme 11 har denne organisme vist sig at være et nyttigt system til undersøgelse af neurobiologi. I betragtning af tilgængeligheden af en kortlagt nematode-forbindelse 1 og mutationer til næsten ethvert gen i nematodegenomet 12 , er vores forståelse for nematoden-nervesystemet og i forlængelse af vores egen del begrænset af designet af kreativt passende analyser.
En række kemotaxisanalyser er blevet udviklet i løbet af de sidste 40 år for at evaluere nematode responsivitet til forskellige aversive stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . Indledende eksperimenter involverede indførelsen af en akut miljøstimulering, mens en enkelt orm gik på en agarplade= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Umiddelbare ændringer i lokomotiv reaktioner blev registreret. F.eks. Kan den flygtige duftende oktanol påføres et hår og væftes foran en nematods næse for at stimulere indledningen af baglæns bevægelse i vildtype orme 17 . Mere komplekse analyser er også udviklet til at inkorporere flere variabler som et middel til at vurdere adfærdsmæssige valg 18 . En variation af dette assay indebærer anvendelsen af en kobberopløsning for at skabe en aversiv midterbarriere 4 . Et attraktivt stof, nemlig diacetyl, blev anbragt på den ene side af den kemiske barriere med orme overført væk fra diacetylkilden. Ormer, der er defekte for kobber-aversive responser, krydsede straks barrieren for at nå diacetylen, mens vildtype orme oprindeligt blev afstødt af barrieren. Svar blev scoret, da ormer først nærmede sig kobberbarrierenUden langsigtede observationer.
Når orme vurderes efter at have været udsat for sultningsbetingelser, nedsættes deres følsomhed over for miljømæssige stimuli 19 . Når den aversive kemiske oktanol blæser frem for nematode næse, stimulerer vildtype organismer baglæns bevægelse inden for 3 – 5 s, når de er på mad. Efter at disse organismer er blevet fjernet fra mad i 10 minutter, udviser de et forsinket respons på 8 – 10 s 20 . Således med øget svimmelhed viser nematoder et svagt aversivt respons på skadelige miljøsignaler, da søgen efter mad bliver mere afgørende for overlevelse. Omvendt reagerer nematoder, der overtrykker neuropeptidreceptor 9 ( npr-9) , ikke på oktanol på eller uden mad og udviser en manglende evne til at reagere på en række aversive stimuli 21 . Disse npr-9 (GF) organismer modulerer heller ikke deres reverseringsfrekvens i nærværelse af mad, men kanOmvendt som reaktion på hårde berøringsstimuleringer, der indikerer at de er i stand til baglæns bevægelse 21 . Vi har også evalueret npr-9 (LF) -mutanter, da de udviser en abnormt nedsat tilbagekoblingsfrekvens af mad, men alligevel kan modulere deres adfærd i nærværelse af mad 21 . Kobling af ormens ernæringsstatus med indførelsen af akutte eksterne stimuli har hjulpet til at belyse de mekanismer, hvormed en fødevarerelateret vej i vid udstrækning kan modulere sensoriske signalveje 22 , 23 . Tilstedeværelsen af mad i nematodmiljøet er også blevet brugt til at evaluere tilbageholdelsesresponser fra etanol 24 . I dette eksperiment blev ormer inkuberet i varierende koncentrationer af ethanol og derefter anbragt på en agarplade med et plaster af fødevarer kendt som et "mad-race-assay". Madplasterne blev anbragt på den ene kant af pladen, mens nematoderne wEre placeret væk fra fødekilden. Ethanoludtagning blev evalueret ved at måle varigheden af det tidsrum, der kræves for orme for at nå fødevaren.
Denne ernæringsbaserede kobberaversionsanalyse bygger på fødevarelabsassayet for at integrere yderligere miljøvariabler, nemlig mad og kobber, mens man vurderer adfærdsændringer over tid. Dette er en tilpasning af en almindelig brugsprotokol i hele C. elegans- fællesskabet 4 . Denne protokol er blevet anvendt til at evaluere aversive responser og påvisning af mad over en fire-timers periode 21 . Da ormen udviser sultedrag efter 30 minutter med fødevaresvigt 25 , kan vi også vurdere, hvordan ændringer i ernæringsstatus kan påvirke miljømæssige reaktioner. Betingelserne for denne analyse måler, hvordan eksperimentelle organismer ændrer responsen til aversive stimuli over tid, og det vurderer derfor adfærdsændringer somOrganismer fremskridt hen imod en sultet tilstand (og fortsatte målinger af langvarig sult). Da npr-9 (GF) dyrene ikke ændrer deres adfærd som følge af mad eller mange aversive tegn, forsøgte vi at identificere, om disse adfærdsmæssige underskud ville fortsætte i tilfælde af sult. I sidste ende er dette analysesignat formuleret til specifikt at evaluere npr-9 (GF) mutanterne, men kan yderligere tilpasses til også at karakterisere nye stammer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette assaydesign modificerer fødevareløbsassayet 24 for at indbefatte en kobberopløsning for at skabe en aversiv midterbarriere og omkring kanten af pladen for at forhindre tab af nematoder. Organer testes for deres evne til at krydse den aversive barriere og nå en mad patch over en 4 h periode. I sammenhæng med npr-9 (GF) har vi brugt denne analyse for at vurdere, hvordan sultningsbetingelser kan påvirke aversive responser og påvisning af mad. Forudsat at vi tidligere havd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Det Naturvidenskabelige og Tekniske Forskningsråd i Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 til William G. Bendena.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
