注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能
Summary
このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D への放射能を生成します。
Abstract
伝統的な 2 D 細胞培養を 3 D 細胞培養にアップグレードするには、多孔質マイクロ cryogels (microcryogels)、様々 な 3 D への放射能を形成する細胞の種類を読み込むことができますを生成する cryogelation 技術が微細加工を統合されている私たち。ここで、多彩な 3 D への放射能と再生医療および創薬スクリーニングに応用を作製するプロトコルを提案する.サイズと形状制御 microcryogels アレイ チップ、またはことができる収穫のオフチップ注射再生療法の個別セル ロード キャリアとして高スループットの 3 D 微少配列にアセンブルされたオンチップ更なる加工できます。薬剤のスクリーニング。これらのマイクロ スケール cryogels の高弾性性質のため 3 D への放射能は射出中に機械的せん断力から細胞を保護することにより低侵襲細胞療法のための素晴らしい injectability を展示します。これにより強化された細胞の生存とマウス下肢虚血モデルにおいて治療効果。一方、標準的なマルチ 384 ウェル フォーマットで 3 D 微少配列のアセンブリは高スループット薬剤のスクリーニングのこの汎用性の高い 3 D 細胞培養プラットフォームで有効にする共通研究施設や設備の使用を促進します。
Introduction
培養皿やウェル プレートなどの平面的な 2次元 (2 D) 表面に従来の携帯文化はほとんどのネイティブ状態に近い細胞の挙動を引き出すことができます。様々 な種類の細胞、細胞外マトリックス三次元 (3 D) アーキテクチャ1,2,3 の生理活性の可溶性因子を構成するネイティブの細胞微小の正確な反復、4、、リニアアクチュエータ組織体外組織工学・再生医学のアプリケーションの構築に不可欠な基礎的生物学および創薬探索5,6,7 ,8,9。
2 D の細胞培養の代わりに生体模倣マイクロ アーキテクチャを事前に 3 D 細胞培養を用い、培養細胞の機能。人気の 3 D 細胞培養法は、集計細胞スフェロイド7,8,9,10にすることです。細胞スフェロイドは、高度な細胞保存と分散した細胞の注入と比較する生存と負傷者の組織に注入できること。ただし、非一様回転楕円体サイズと注入中に流体せん断力によって細胞に課された必然的な機械的損傷が悪い細胞治療効果11,12,13に します。同様に、回転楕円体の集計中に固有の不均一 3 D 細胞を用いた高スループット薬剤のスクリーニングの挑戦10への翻訳をしました。
3 D 細胞培養のための別の方法は、通常水性ゲルまたは多孔質のセルをカプセル化する生体材料学分野の援助によって達成されます。3 D アーキテクチャを構築する上で大きな柔軟性が可能です。治療のため一括足場にカプセル化細胞通常外科的移植、侵襲性、外傷性、それゆえに枕元にその翻訳を制限することで動物の体に配信されます。その一方で、水性ゲルは、熱 – 化学か酵素架橋11経由の in situゲルを許可する、動物の体にヒドロゲル前駆体溶液中に浮遊細胞を注入することにより低侵襲治療を有効にします。ただし、ヒドロゲル前駆物質水溶液の州はまだながら、細胞が配信されると彼らにさらされている機械的せん断注入中。ない限り、その場でゲル化ハイドロゲルの中に化学か酵素の架橋も内細胞への損傷を課す可能性があります。薬剤スクリーニングのため生体材料による細胞培養の均一性、制御性とスループットの問題に直面します。ヒドロゲルを使用すると、細胞の通常関与するゲル化、中にセル実行可能性と機能、プロセスを影響可能性があります。ヒドロゲルの細胞、播種前にゲル化を防ぐために氷の上に保持する必要がありますのでヒドロゲルの精度を確保するため通常非常に薄い調剤のヒント ・ ジャムが、細胞中にゲル化もほとんどの高スループット装置によって使用を妨げ高スループット スクリーニング。前もって形成された足場でした可能性のある個別の生体材料作製手順細胞培養から足場ベースの製品が比較的低いスループット14バルク材料として利用できるしかし、ほとんど。
現在の 3 D 培養法の欠点のいくつかを克服するために市販で使いやすい microcryogel アレイ チップ15を作製する微細加工 cryogelation 統合技術を開発しました。このプロトコルでは、それは生体適合性、分解性、費用対効果と細胞接着に必要なそれ以上の変更はない microcryogel 作製技術を実証するためゼラチンが選択されます。天然または合成のソースの他のポリマーは、作製、アプリケーションによっても使用できます。この技術を使って制御可能なサイズ、形状、レイアウトと小型と高弾性 microcryogels 作製することができます。さまざまな種類の細胞と共に読み込まれる、3 D への放射能は様々 なアプリケーションに対して作成でした。これらのユニークな特徴は、噴射に生体内で強化された治療効果について希望 injectability、セルの保護およびサイト指示された保存を有効にします。ない限り、一般的な実験装置と多彩な薬剤のスクリーニングおよび他の細胞アッセイのハイスループットの細胞培養を実現する機器と互換性のある 3 D 微少アレイを形成するため、microcryogels をさらに処理でした。ここで、我々 もの microcryogels と個々 の 3 D への放射能または 2 つの重要なアプリケーション、細胞治療、創薬スクリーニング、それぞれ10,15 の 3 D 微少配列とその後の治療の作製プロセスを詳細します。.
Protocol
Representative Results
Discussion
薬剤スクリーニングのための再生医学との in vitroモデルは、組織工学5,6,7,8,9の 2 つの重要なアプリケーションです。これらの 2 つのアプリケーションは、非常に異なるニーズを持って、それらの間の共通点ある培養条件詳細バイオミメティックのセル関数<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は中国国家自然科学基金によって財政上支えられる (補助金: 81522022、51461165302)。著者は、デュ研究室メンバーの一般的な支援を認めたいと思います。
Materials
| Gelatin | sigma | G7041 | All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated. |
| Glutaraldehyde | J&K | 902042 | Used as crosslinker in preparation of material. |
| Glass cover slip (24X50mm) | CITOGLASS, China | 10212450C | To scrape prcursor solution onto microstencils array chips. |
| Sodium borohydride, NaBH4 | Beijing Chemical Works | 116-8 | To wash remaining glutaraldehyde away after gelation. |
| Vacuum jar | asperts, China | VC8130 | To preserve microgels under vacuum. |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets | Sunjin Electronics Co., Ltd, China | Ordinary PMMA sheets. | |
| Rayjet laser system | Rayjet, Australia | Rayjet 50 C30 | To engrave PMMA sheets to form wells. |
| Plasma Cleaner | Mycro Technologies, USA | PDC-32G | To make PMMA hyphophilic. |
| Lyophilizer | Boyikang, China | SC21CL | To lyophilize materials. |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Zhongkekeao, China | DA0065 | To dye microgels. |
| Doxorubicin hydrochloride | ENERGY CHEMICAL, China | A01E0801360010 | To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel. |
| Live/dead assay | Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) | CS01-10 | To distinguish alive and dead cells. |
| Cell Titer-Blue | Promega (Wisconsin, USA). | G8080 | To test cell viability. |
| Cell strainer | BD Biosciences, USA | 352360 | To collect microgels. |
| D-Luciferin | SYNCHEM (Germany) | s039 | To tack cells. |
| Scanning electron microscope | FEI, USA | Quanta 200 | To characterize microgel morphology. |
| Mechanical testing machine | Bose, USA | 3230 | To measure mechanical features. |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | ALADINI 1000 | To test injactabiliy. |
| Digital force gauge | HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China | H-50 | To test injactabiliy. |
| Ethylene oxide sterilization system | Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC | AN74i | To sterilize microgels with ethylene oxide gas. |
| Microplate reader | Molecular Devices,USA | M5 | To measure fluorescence intensity in micro-array. |
| Confocal microscope | Nikon, Japan | A1Rsi | To observe cell distribution in 3D. |
| Xenogen Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences, USA | IVIS | To track cell in animals. |
| Liquid work stataion | Apricot design,USA | S-pipette | To load medium or cell suspension high-throuputly. |
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