주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

Summary

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

Abstract

3D 세포 배양에 전통적인 2D 셀 문화를 업그레이드 하려면 우리 cryogelation 기술로 3D microtissues를 형성 하기 위하여 세포 유형의 다양 한 적재 될 수 있다 macroporous 미 cryogels (microcryogels), 생산 소를 통합 했습니다. 여기, 우리는 다양 한 3D microtissues와 재생 치료와 약물 검사에 응용 프로그램을 조작 하는 프로토콜을 제시. 크기와 모양을 제어할 수 microcryogels 하거나 수 있는 수확된 칩 재생 주사 치료에 대 한 개별 셀 로드 사업자로 조립된 온-칩 높은 처리량에 대 한 3D microtissue 배열에 추가 되는 배열 칩에 날조 될 수 있다 의약품 심사입니다. 높은 탄성의 특성상 이러한 미 cryogels, 3D microtissues 주입 시 기계적 전단 힘에서 세포를 보호 하 여 최소 침 습 세포 치료에 대 한 큰 injectability를 전시 한다. 이 향상 된 세포 생존 및 마우스 사지 허 혈 모델에서 치료 효과 보장합니다. 한편, 3D microtissue 배열 표준 384-멀티-잘 형식에의 높은 처리량 약물이 다양 한 3D 셀 문화 플랫폼에 상영 활성화 일반적인 실험실 시설 및 장비, 사용 용이.

Introduction

문화 요리 등 다 잘 접시, 일반된 2 차원 (2D) 표면에 전통적인 세포 배양 수 거의 그들의 원시 상태에 가까운 셀 동작을 유도 했다. 다양 한 세포 유형, 세포 외 매트릭스 및 3 차원 (3D) 아키텍처^{1,2,3 에에서 생리 활성 성 요인의 구성 하는 기본 세포 microenvironments의 정확한 재현 부 4}, biomimicking 조직에서을 체 외에서 조직 공학, 재생 의학, 응용 프로그램 생성에 필수적 이다 기본적인 생물학 연구 및 약물 검색^{5,6,7 ,,89}.

2 차원 세포 배양, 대신 3D 세포 배양은 널리 biomimetic 마이크로 건축을 이용 하 고 생체 외에서배양 세포의 기능적 특징. 인기 있는 3 차원 셀 문화 방법은 spheroids^7,,89,10로 집계 셀 것 이다. 세포질 spheroids 향상 된 세포 보존 및 분산 된 세포의 주입에 비해 생존 부상된 조직에 주입 수 있습니다. 그러나, 비균일 회전 타원 체 크기와 세포에 주입 하는 동안 유체 전단 힘에 의해 부과 하는 피할 수 없는 기계 부상 이어질 가난한 셀 치료 효과^11,,1213. 마찬가지로, spheroids의 집계 하는 동안 고유의 비 균일 그들의 번역을 3D 셀 기반 높은 처리량 마약 도전¹⁰상영을 했다.

3D 세포 배양에 대 한 또 다른 방법은 일반적으로 수성 hydrogels 또는 다공성 건설 기계 셀을 캡슐화 바이오의 도움으로 이루어집니다. 그것은 3D 아키텍처를 구축에 더 큰 융통성을 허용 한다. 치료, 세포 대량 건설 기계에는 침략 적 이며 외상, 머리 맡에는 다양 한 번역을 따라서 제한 수술 주입을 통해 동물의 시체에 보통 전달 된다. 다른 한편으로, 수성 hydrogels 제자리에서 겔 화 온도-, 화학 또는 효소 가교¹¹를 통해 수 있도록 동물 시체로 히드로 전조 솔루션에 정지 세포를 주입 하 여 최소 침 습 치료를 사용 합니다. 그러나, 셀 하이드로 겔 선구자 수성 상태에 아직도 있는 하는 동안 전달 됩니다, 그들은 또한 노출 됩니다 기계적 전단에 주입 하는 동안. 만 그리 하이드로 겔의 겔 화 현장에서 중 화학 또는 효소 가교 내 세포에 손상을 부과 또한 수 있습니다. 약물 검사에 대 한 소재를 이용한 세포 배양 균일성, 제어력 및 처리량 문제를 얼굴. Hydrogels 사용 하 여, 세포는 일반적으로 참여 겔 화, 동안는 프로세스 영향을 미칠 수 세포 생존 능력 및 기능. 셀 시드 동안 겔 화 또한 저해 사용 대부분 높은 처리량 장비는 히드로 셀 시드 전에 겔 화를 방지 하기 위해 얼음에 보관 해야 할 수 있기 때문에 히드로 정확도 보장 하기 위해 일반적으로 매우 얇은 분배 팁 잼 수 있습니다. 높은 처리량 심사입니다. 그러나 미리 형성 된 건설 기계 수 잠재적으로 별도 소재 제조 절차 세포 배양에서 가장 비 계 기반 제품은 상대적으로 낮은 처리량¹⁴대량 자료로 사용할 수 있습니다.

현재 3D 문화 방법의 단점 들을 극복 하기 위해 상용 하 고 사용자 친화적인 microcryogel 배열 칩¹⁵조작 하 소-cryogelation 통합 기술을 개발 했습니다. 이 프로토콜에 젤라틴으로 생체, 분해성, 비용, 추가 수정에 필요한 및 셀 첨부 파일 microcryogel 제조 기법을 예증 선택 합니다. 천연 또는 합성 근원의 다른 고분자 어플리케이션 제작을 위해 사용 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리는 소형 및 높은 탄력 있는 microcryogels 제어 크기, 모양 및 레이아웃을 조작 수 있습니다. 다양 한 세포 유형으로 로드 될 때 3D microtissues 다양 한 응용 프로그램에 대 한 형성 될 수 있습니다. 이러한 독특한 기능은 가능 원하는 injectability, 셀 보호 및 보존 사이트 감독 주입에서 vivo에서 향상 된 치료 효과 대 한 후 만 그리는 microcryogels 일반적인 실험실 장비 및 다양 한 마약 검사 및 다른 세포질 분석 실험에 대 한 높은-처리량 셀 문화를 실현 하기 위해 악기와 호환 되는 3D microtissue 어레이를 더 처리할 수 수 없습니다. 여기, 우리 microcryogels과 개별 3D microtissues 또는 두 가지 중요 한 응용 프로그램, 세포 치료 및 의약품 심사, 각각^{10,15 3D microtissue 배열 후 치료의 제작 과정을 자세히 한다} .

Protocol

동물 실험 동물 윤리 위원회에 센터의 생물 분석, 칭화 대학에 의해 찬성 하는 엄격한 프로토콜을 따 랐 다. 윤리 위원회의 승인 아래 인간 지방 조직에서 환자 동의와 부의 성형 수술의 북경 연합 병원에서 얻은 했다. 1. 3D Microcryogels의 제조 microstencil 배열 칩의 설계 및 제조 디자인 배열 특정 형상, 원 등의 상용 소프트웨어를 사용 하 여 타원, 삼각?…

Representative Results

제조 그리고 3D microtissue 형성에 대 한 microcryogels의 특성. 이 프로토콜에 따라 microcryogels 형태로 3D microtissues 및 개별 microcryogels 또는 microcryogel 배열 조작 했다 고 재생 치료와 약물 검사, 각각 (그림 1)에 적용 했다. Microstencil 배열 칩 PMMA에서 조작 microcryogel 어레이 칩에 대 한 micromolds로 적용 되?…

Discussion

마약 검사에 대 한 재생 의학 및 생체 외에서 모델은 조직 공학^5,6,7,,89에 대 한 두 가지 중요 한 응용 프로그램입니다. 이러한 두 응용 프로그램을가지고 있지만 다른 요구, 그들 사이의 공통 분모를 셀 기능¹⁹를 향상 시키기 위해 더 많은 biomimetic 경작…

Materials

Gelatin	sigma	G7041	All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde	J&K	902042	Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm)	CITOGLASS, China	10212450C	To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar	asperts, China	VC8130	To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets	Sunjin Electronics Co., Ltd, China		Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system	Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer	Boyikang, China	SC21CL	To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%)	Zhongkekeao, China	DA0065	To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride	ENERGY CHEMICAL, China	A01E0801360010	To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)	CS01-10	To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	To test cell viability.
Cell strainer	BD Biosciences, USA	352360	To collect microgels.
D-Luciferin	SYNCHEM (Germany)	s039	To tack cells.
Scanning electron microscope	FEI, USA	Quanta 200	To characterize microgel morphology.
Mechanical testing machine	Bose, USA	3230	To measure mechanical features.
Programmable syringe pump	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	To test injactabiliy.
Digital force gauge	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China	H-50	To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader	Molecular Devices,USA	M5	To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope	Nikon, Japan	A1Rsi	To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	To track cell in animals.
Liquid work stataion	Apricot design,USA	S-pipette	To load medium or cell suspension high-throuputly.