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Bioengineering

Microtissues 3D pour thérapie régénérative Injectable et de dépistage des drogues de haut débit

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/55982
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine,Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences,Tsinghua University

Summary

Ce protocole décrit la fabrication de microcryogels élastique macroporeux 3D en intégrant la microfabrication avec la technologie cryogelation. Lorsqu’il se charge avec des cellules, microtissues 3D sont générés, qui peut être facilement injecté in vivo pour faciliter la thérapie régénérative ou assemblés dans des tableaux pour in vitro le dépistage des drogues de haut débit.

Abstract

Pour mettre à niveau de culture cellulaire 2D traditionnel pour la culture cellulaire 3D, nous avons intégré microfabrication avec technologie cryogelation pour produire macroporeux microscale criogels (microcryogels), qui peuvent être chargés avec une variété de types de cellules pour former des microtissues 3D. Ici, nous présentons le protocole pour fabriquer polyvalent microtissues 3D et leurs applications en thérapie régénératrice et de dépistage des drogues. Taille et forme contrôlable microcryogels peuvent être fabriqués sur une puce de tableau, qui peut être récoltée hors puce comme individuels transporteurs chargés en cellule pour la thérapie régénérative injectable ou être plus assemblé sur puce en tableaux micro-culture 3D à haut débit dépistage des drogues. En raison de la nature élastique haute de ces criogels a petite Echelle, les 3D microtissues pièce grande injectabilité de thérapie cellulaire mini-invasive en protégeant les cellules de la force de cisaillement mécanique pendant l’injection. Cela garantit la survie cellulaire accrue et un effet thérapeutique chez la souris limb ischémie. Pendant ce temps, assemblage des matrices 3D micro-culture dans un format standard de multi-384 puits facilite l’utilisation de laboratoires communs et l’équipement, permettant à haut débit drug screening sur cette plate-forme de culture cellulaire 3D polyvalent.

Introduction

La culture cellulaire traditionnel sur aplatie à deux dimensions (2D) des surfaces comme une boîte de Petri ou plaques multipuits, peut susciter guère les comportements de cellule à proximité de leurs États indigènes. Précise récapitulation des micro-environnements cellulaires natives, qui comprennent des divers types de cellules, matrices extracellulaires et bioactifs facteurs solubles dans des architectures en trois dimensions (3D)1,2,3 ,4, il est essentiel de construire biomimicking tissus in vitro pour des applications en médecine de génie, régénératrice tissulaire, biologie fondamentale recherche et drogue découverte5,6,7 ,8,9.

Au lieu de la culture de cellules 2D, culture cellulaire 3D est employé couramment pour faire avancer la biomimétique micro-architecturales et des caractéristiques fonctionnelles des cellules cultivées in vitro. Une méthode de culture cellulaire 3D populaire est aux cellules agrégées en sphéroïdes7,8,9,10. Sphéroïdes cellulaires pourraient être injectés à des tissus lésés avec rétention cellulaire améliorée et la survie en comparaison de l’injection de cellules dispersées. Toutefois, tailles de sphéroïde non uniforme et une lésion mécanique inévitable imposée sur des cellules par la force de cisaillement fluide pendant l’injection de conduisent à cellule pauvres effets thérapeutiques11,12,13. De même, la non-uniformité inhérente au cours de l’agrégation des sphéroïdes a fait sa traduction à base de cellules 3D haut débit médicament dépistage difficile10.

Une autre méthode pour la culture cellulaire 3D est réalisée avec l’aide de biomatériaux, qui généralement encapsule les cellules d’hydrogels aqueux ou échafaudages poreux. Il permet une plus grande marge de manœuvre dans la construction d’architectures 3D. Pour la thérapie, les cellules encapsulées dans les échafaudages en vrac sont généralement livrées à corps animal par implantation chirurgicale, qui est envahissant et traumatique, limitant par conséquent sa traduction large au chevet du patient. En revanche, hydrogels aqueuses permettent la thérapie mini-invasive en injectant des cellules en suspension dans la solution de précurseur d’hydrogel dans des organes animaux, permettant en situ gélification par thermo-, réticulation chimique ou enzymatique11. Cependant, comme les cellules sont livrées tandis que les précurseurs de l’hydrogel sont encore dans un État aqueux, ils sont également exposés à cisaillement mécanique pendant l’injection. Non seulement cela, réticulation chimique ou enzymatique au cours in situ la gélification de l’hydrogel pourrait aussi imposer des dommages aux cellules à l’intérieur. Pour le dépistage des drogues, des cultures de cellules de biomatériau assistée rencontrent des difficultés uniformité, de débit et de contrôlabilité. Utilisent de l’hydrogel, cellules sont généralement impliqués au cours de la gélification, par laquelle le processus peut affecter de fonction et la viabilité cellulaire. Gélification au cours de l’ensemencement de la cellule entrave également l’utilisation par la plupart des équipements haut débit, car l’hydrogel peut doivent rester sur la glace pour empêcher la gélification avant l’ensemencement de cellule, et l’hydrogel peut se coincent conseils de distribution, qui sont généralement très minces pour assurer l’exactitude des criblage à haut débit. Échafaudages préformés pourraient séparer potentiellement des procédures de fabrication biomatériau de culture cellulaire, mais la plupart produits axés sur l’échafaudage sont disponibles en vrac avec relativement plus faible débit14.

Pour surmonter certains des inconvénients des méthodes de culture 3D actuelles, nous avons développé une technologie de microfabrication-cryogelation intégré pour fabriquer un tableau de microcryogel standard et convivial puce15. Dans ce protocole, la gélatine est sélectionnée pour illustrer la technique de fabrication de microcryogel car il est biocompatible, dégradable et rentable, et aucune modification supplémentaire n’est nécessaire pour la fixation des cellules. Autres polymères de sources naturelles ou synthétiques pourraient également être utilisés pour la fabrication, selon l’application. Grâce à cette technologie, nous pouvons fabriquer microcryogels miniaturisée et très élastique avec mise en page, la forme et la taille contrôlable. Lors du chargement d’une variété de types de cellules, microtissues 3D pourrait être formé pour diverses applications. Ces caractéristiques uniques permettent d’injectabilité désirée, de la protection des cellules et de rétention dirigée après injection en vivo pour des effets thérapeutiques. Non seulement cela, les microcryogels pourraient être traitées ultérieurement pour former des tableaux micro-culture 3D compatibles avec les équipements communs de laboratoire et instruments pour réaliser la culture de cellules de haut débit pour le dépistage des drogues polyvalent et autres analyses cellulaires. Ici, nous allons détailler le processus de fabrication de microcryogels et son post traitement individuel microtissues 3D ou 3D micro-culture tableaux pour deux applications importantes, de thérapie cellulaire et de dépistage des drogues, respectivement10,15 .

Protocol

l’expérimentation animale suivi strict protocole approuvé par le Comité d’éthique animale sur le centre d’analyse biomédicale, Université de Tsinghua. En vertu de l’approbation du Comité d’éthique, le tissu adipeux humain a été obtenu du département de chirurgie plastique de Peking Union Hospital avec le consentement éclairé des patients. 1. fabrication de 3D Microcryogels conception et la fabrication de puces de tableau de microstencil <…

Representative Results

Fabrication et caractérisation des microcryogels pour la formation de micro-culture 3D. Selon ce protocole, microcryogels ont été fabriqués à forme la 3D microtissues et des microcryogels individuels ou des tableaux de microcryogel et ont été appliquées à la thérapie régénérative et drogue, dépistage, respectivement (Figure 1). Puces de tableau Microstencil fabriqués …

Discussion

Modèles de médecine et in vitro régénératrices pour le dépistage des drogues sont deux applications importantes pour les tissus techniques5,6,7,8,9. Alors que ces deux applications ont des besoins très différents, un terrain d’entente entre les deux réside dans la nécessité d’une plus biomimétique condition de culture afin d’amélior…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions : 81522022, 51461165302). Les auteurs tiennent à remercier tous les membres Du laboratoire d’aide générale.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.
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Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).
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