Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.
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Articolo metodologico
Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue
In questo articolo
Sommario
Abstract
La cartilagine articolare umana manca la capacità di ripararsi. La degenerazione di cartilagine viene quindi trattata non da curative ma da trattamenti conservatori. Attualmente si stanno impegnando a rigenerare la cartilagine danneggiata con condrociti espansi ex vivo o cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSCs). Tuttavia, la restrittività e l'instabilità di queste cellule limitano la loro applicazione nella ricostruzione della cartilagine. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) hanno ricevuto l'attenzione scientifica come una nuova alternativa per le applicazioni rigenerative. Con abilità illimitate di auto-rinnovamento e multipotenza, i hiPSCs sono stati evidenziati come una nuova sorgente di sostituzione cellulare per la riparazione della cartilagine. Tuttavia, l'ottenimento di un'elevata quantità di pellets condizionati di alta qualità è una sfida importante per la loro applicazione clinica. In questo studio abbiamo usato cellule embrionali (EB) derivate per la differenziazione condrogenica. La chondrogenesi di successo è stata confermata da PCRD con blu alcian, toluidina blu e anticorpi contro i tipi di collagene I e II (COL1A1 e COL2A1 rispettivamente). Forniamo un metodo dettagliato per la differenziazione dei iPSC (CBMC-hiPSCs) derivati da cellule mononucleari di sangue del cordone in pellet condondenso.
Introduzione
L'uso di hiPSC rappresenta una nuova strategia per lo screening dei farmaci e studi meccanistici di varie malattie. Da una prospettiva rigenerativa, i hiPSC sono anche una potenziale fonte per la sostituzione di tessuti danneggiati che hanno capacità di guarigione limitata, come la cartilagine articolare 1 , 2 .
La rigenerazione della cartilagine articolare nativa è stata una sfida per diversi decenni. La cartilagine articolare è un morbido tessuto bianco che copre la fine delle ossa, proteggendole dall'attrito. Tuttavia, ha una capacità di rigenerazione limitata quando è ....
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Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale dell'Università Cattolica della Corea (KC12TISI0861). I CBMC utilizzati per la riprogrammazione sono stati direttamente ottenuti dalla Banca di Cord Blood del Seoul St. Mary's Hospital.
1. Differenziazione condensata da iPSC
- Generazione CBMC-iPSC
- Generare CBMC-hiPSC utilizzando il protocollo mostrato nel nostro lavoro precedente 23 .
- Raccogliere le cellule del sangue in un tubo conico da 15 ml e contare con un emocitometro.
- Preparare 3 x 10 5 cellule e centrifugare....
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Risultati
In questo studio, abbiamo generato pellet condensatori da CBMC-hiPSCs indurre cellule outgrowth da EBs. La differenziazione condrogenica è stata indotta usando CBMC-hiPSC con elevata pluripotenza 11 confermata. Uno schema semplice del nostro protocollo è mostrato in Figura 1A . Prima della differenziazione, le colonie iPSC sono state ampliate ( Figura 1B ). IPSC espansi sono stati assemblati come EB per i.......
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Discussione
Questo protocollo ha generato hiPSC da CBMC. Abbiamo riprogrammato i CBMC a hiPSC utilizzando un vettore virale Sendai contenente fattori Yamanaka 24 . Tre casi sono stati utilizzati nella differenziazione, e tutti gli esperimenti hanno generato con successo i pellet condrodotti utilizzando questo protocollo. Numerosi studi hanno riportato protocolli per la differenziazione dei hiPSC nei condrociti 25 , 26 , 2.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto R & D di tecnologia della Corea del Sud, Ministero della Sanità, del Welfare & Famiglia, della Repubblica di Corea (HI16C2177).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Plastica | |||
| 100 mm Piatto | TPP | 93100 | |
| Piastra a 6 pozzetti | TPP | 92006 | |
| Provetta cornica da 50 mL | SPL | 50050 | |
| Provetta cornica da 15 mL | SPL | 50015 | |
| Pipetta monouso da 10 mL | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Pipetta monouso | Falcon | 7543 | |
| Piastra a 12 pozzetti | TPP | 92012 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | >Description |
| E8 Medium Materials | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | E8 Medium (500 mL) |
| Bicarbonato di sodio | Life Technologies | 25080-094 | E8 Medium (Conc.: 543 μ g/mL) |
| Selenito di sodio | Sigma Aldrich | S5261 | E8 Medium (Conc.: 14 ng/mL) |
| Trasformatore Umano | Sigma Aldrich | T3705 | E8 Medio (Conc.: 10.7 μ g/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | E8 Medium (Conc.: 100 ng/mL) |
| Insulina umana | Life Technologies | 12585-014 | E8 Medium (Conc.: 20 μ g/mL) |
| TGF&beta umano; 1 | Peprotech | 100-21 | E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL) |
| Acido Ascorbico | Sigma Aldrich | A8960 | E8 Medium (Conc.: 64 μ g/mL) |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| Inibitore ROCK | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Nome< | strong>Company | Numero di catalogo | Description |
| Controllo di qualità Materiali | |||
| 18 mm Vetro di copertura | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovazione | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Siero bovino Albumina vettoriale | Lab | SP-5050 | |
| Anticorpo SSEA4 | Millipore | MAB4304 | |
| Anticorpo Anti-Oct4 | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anticorpo TRA-TRA-1-60 | Millipore | MAB4360 | |
| Anticorpo anti-Sox2 | Biolegend | 630801 | |
| Anticorpo anti-TRA-1-81 | Millipore | MAB4381 | |
| Anticorpo anti-Klf4 Abcam | ab151733 | ||
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo | Sonda molecolare | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo | Sonda molecolare | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Reagente antisbiadimento oro prolungato | Invitrogen | P36934 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovazione | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Siero bovino Albumina | vettoriale Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagene II anticorpo | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Blu Alciano | Sigma Aldrich | A3157-10G | |
| Verde veloce FCF | Sigma Aldrich | F7252-25G | |
| Safranin O | Sigma Aldrich | 090m0039v | |
| Nucleare veloce rosso | Americanmastertech | STNFR100 | |
| xilene | Duksan | 115 | |
| Etanolo | Duksan | 64-17-5 | |
| soluzione di ematossilina di Mayer | wako pure chemical industries | LAK7534 | |
| DAP | VECTOR LABORATORIES | SK-4100 | |
| Vetrino scorrevole, rivestito | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Cloroformio | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Etanolo | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| Nome | Company | Numero di catalogo | Descrizione |
| Materiali di differenziazione condrogenica | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | Componente del terreno condrogenico (500 mL) |
| Penicilina Streptomicina | Life Technologies | P4333 | Componente del mezzo condrogenico (Conc.: 1%) |
| Acido ascorbico | Sigma Aldrich | A8960 | Componente condrogenica del terreno (Conc.: 64 μ g/mL) |
| Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x) | Life Technologies | 11140-050 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 100 mM) |
| rhBMP-2 | R& D | 355-BM-050 | Componente del terreno condrogenico (Conc.:100 ng/ml) |
| Hman ricombinante TGF-beta3 | R& D | 243-B3-002 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 10 ng/ml) |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%) |
| ITS+ Premix | BD | 354352 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%) |
| Desametasone-solubile in acqua | Sigma Aldrich | D2915-100MG | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 10-7 M) |
| GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%) |
| Soluzione di piruvato di sodio | Sigma | Aldrich S8636 | Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%) |
| L-Prolina | Sigma Aldrich | P5607-25G | Terreno condrogenico componente (40 μ g/ml) |
Riferimenti
- van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
- Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissu....
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Ristampe e permessi
