Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence
Summary
La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.
Abstract
L’appareil de Golgi est constitué de saccules membranaires empilées en série qui peuvent être également classés en régions sub-Golgi, y compris le cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi et trans-réseau de l’appareil de Golgi. Les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi sont déterminées par la répartition de ses protéines résidentes. La résolution spatiale de microscopie optique conventionnelle est trop faible pour résoudre la structure sub-Golgi ou saccules. Ainsi, la microscopie immuno-or est une méthode de choix pour localiser une protéine au niveau sub-Golgi. Cependant, la technique et l’instrument sont au-delà de la capacité de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Nous décrivons ici notre méthode développée récemment Super-résolution appelée localisation des protéines Golgi par imagerie centres de masse (GLIM) systématiquement et quantitativement localiser une protéine de Golgi. GLIM est basé sur les protocoles d’étiquetage de fluorescence standard et grand champ conventionnel ou microscopes confocaux. Il s’agit de l’étalonnage de l’aberration chromatique-Maj du système microscopique, l’acquisition de l’image et l’analyse postérieure à l’acquisition. La localisation de sub-Golgi d’une protéine test est exprimée quantitativement comme le quotient de localisation. Il existe quatre principaux avantages de GLIM ; C’est rapide, basé sur les outils et les méthodes conventionnelles, le résultat de la localisation est quantitatif, et qu’elle leur offre ~ résolution pratique de 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Nous décrivons ici le protocole détaillé de GLIM pour localiser un test de la protéine de l’appareil de Golgi.
Introduction
Le complexe de Golgi joue un rôle essentiel dans sécrétoire/endocytose traite des protéines et des lipides (ci-après les cargaisons) dans les cellules de mammifères,1,2,3. À l’appareil de Golgi, cargaisons sont non seulement triées dans divers compartiments subcellulaires mais aussi modifiés par divers types de glycosylation. Le complexe de Golgi mammifères se compose de nombreuses cheminées de Golgi latéralement connectées, qui se compose généralement de 4-11 sacs de membrane étroitement adjacentes et plat appelés saccules. Les saccules de Golgi empilées en série sont classés plus loin, d’un bout à l’autre, tout comme médiale, ciset trans-cisternes. À la trans-côté d’une pile de Golgi, le trans-plupart sac de membrane se développe en un réseau de membrane tubulaire et le réticulum, appelé le trans-Golgi network (TGN)4. Dans la voie de sécrétion, cargaisons provenant de réticulum endoplasmique (re) entrer dans une cheminée de Golgi à la cis-côté et puis séquentiellement traversent médiale et trans-cisternes. Cargaisons finit par sortir l’appareil de Golgi à la trans-Golgi ou TGN destinant à la membrane plasmique, les endosomes ou les granules de sécrétion.
Les mécanismes moléculaires et cellulaires du comment des cargaisons de transit une pile de l’appareil de Golgi et comment l’appareil de Golgi maintient son organisation saccules restent mystérieux et sont actuellement encore un débat houleux1. Une des difficultés dans ce domaine est que les saccules de Golgi ne peuvent être résolus en vertu de la microscopie électronique (EM) depuis la résolution du microscope optique (~ 200 nm) est insuffisante pour résoudre différents saccules de Golgi (< 100 nm dans les deux épaisseur de saccules et la distance). Donc, la localisation de sub-Golgi des protéines résidentes et transit des cargaisons sont classiquement déterminés par l’EM immuno-or. Toutefois, l’EM immuno-or est très pointues et il est au-delà des capacités de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Bien que la résolution de l’EM peut être Sub nanomètre, la résolution offerte par le EM immuno-or est considérablement entravée par la taille de l’anticorps complexe (principales et l’anticorps secondaire) et les particules d’or, et il peut être pire que 20 nm. En outre, des images de EM sont obtenus à partir 2D minces au lieu d’une 3D vision globale de l’appareil de Golgi, ce qui peut aboutir à des conclusions erronées selon la position relative et l’orientation de la section 2D5. Par exemple, étudier une EM single-section ne peut pas fiable différencier une vésicule de la vue orthogonale d’un tubule puisque les deux peuvent afficher des profils identiques membrane rond. L’avènement récent des techniques de microscopie de Super-résolution, telles que la microscopie éclairage structuré 3D (3D-SIM), stimulée par épuisement des émissions (STED), microscopie de localisation de photoactivation (PALM) et (microscopie) reconstruction optique stochastique STORM), permet de résoudre les structures sub-Golgi sous lumière microscopes6. Cependant, il y a au moins quatre inconvénients qui peuvent considérablement limiter leurs utilisations dans l’étude biologique de la cellule de l’appareil de Golgi. 1) les techniques actuelles de Super-résolution nécessitent une configuration matériel coûteux et spécial qui dépasse la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. 2) protocoles d’étiquetage de fluorescence spéciaux sont nécessaires pour certaines techniques de Super-résolution. 3) bien que, dans les meilleures conditions, ces techniques de réclamer 20-110 nm à résolution spatiale, la résolution pratique obtenue dans des échantillons réels peut être bien pire. 4) par rapport à la microscopie conventionnelle, ces techniques de Super-résolution encore ont des difficultés dans la conduite de multicolores, 3D ou vivent d’imagerie cellulaire, seules ou en combinaison. Probablement plus important encore, fois EM immuno-or et les techniques de microscopie de Super-résolution rendement qualitatif plutôt que des données quantitatives de localisation.
Tenter de résoudre partiellement les problèmes mentionnés ci-dessus, nous avons récemment développé une méthode de microscopie conventionnelle basée, qui se nomme la localisation des protéines Golgi Imaging centres de masse (GLIM), systématiquement et quantitativement localiser un appareil de Golgi protéine à une résolution équivalente à celle de l’immuno-or EM7. Dans cette méthode, l’appareil de Golgi dans des cellules de mammifères est dispersée comme mini-piles de l’appareil de Golgi par le traitement de la nocodazole, un médicament dépolymérisation des microtubules. Des études approfondies ont démontré qu’induite par la nocodazole Golgi mini-piles (ci-après Golgi mini-cheminées) sont très proches de natives stacks de Golgi dans les organisations et les fonctions cellulaires8,9,10, 11. Le quotient de la localisation (LQ) d’une protéine de test peut être acquises par le biais de GLIM et il dénote la localisation sup-Golgi quantitative. Les valeurs numériques de LQs peuvent être comparés et une base de données LQ de plus de 25 marqueurs de Golgi est disponible.
GLIM, mini-piles de l’appareil de Golgi sont marqués au triple GM130 endogène ou exogène exprimée, GalT-mCherry et la protéine test (x). GM130 et GalT-mCherry, cis– et trans-Golgi marqueurs respectivement12,13, constituent des points de référence. La fluorescence triple, rouge (R), vert (G) et (B) rouge sombre, artificiellement apparaissent en rouge, vert et bleu, respectivement. Centre de masse de fluorescence (ci-après le centre) est adoptée pour régler les sous-pixels. L’axe de l’appareil de Golgi est défini comme le vecteur de la centre de GM130 à celui de GalT-mCherry. La mini-pile Golgi est modélisée comme une structure cylindrique avec une symétrie rotationnelle infinie autour de l’axe de l’appareil de Golgi. Par conséquent, une mini-pile de Golgi peut être modélisée de davantage comme une structure unidimensionnelle selon l’axe de l’appareil de Golgi. Le LQ de la protéine test dx/d1, dans lequel dx est la distance entre le centre de x à celle de GM130, tandis que d1 correspond à la distance depuis le centre de GalT-mCherry à celle de GM130 correspond à x. Si le centre de x est hors-axe, sa distance axiale de projection est utilisé pour le calcul. Schématiquement, les variables, y compris de Golgi axe, angle axial, dx, d1, angle α et β de l’angle, pour GLIM sont illustrées à la Figure 1. LQ est indépendante de l’angle axial de Golgi mais mini-piles de l’appareil de Golgi orientent aléatoirement dans une cellule.
Mini-piles de l’appareil de Golgi apparaissent non homogènes dans les images. Nous avons développé trois critères pour sélectionner analysables Golgi mini-piles pour GLIM. 1) le critère de rapport signal-sur-bruit, dans lequel le rapport de l’intensité totale d’une pile mini de Golgi à la déviation standard (SD) de l’arrière-plan est ≥ 30 dans chaque canal. Ce critère est d’assurer la précision de positionnement du centre de masse, qui repose sur les rapports signal-bruit de mini-piles de l’appareil de Golgi. 2) le critère angle ou la distance axial, qui exige d1≥ 70 nm. d1 diminue avec l’augmentation de l’angle axial de l’appareil de Golgi. Quand l’angle axial est proche de 90° ou verticale, la minipile devient non-être résolu comme d1 est proche de 0. d1≥ 70 nm peut effectivement exclure près verticale mini piles d’appareil de Golgi. 3) le critère de colinéarité, dans laquelle soit | tan α | ou | tan β | est ≤ 0,3. Ce critère s’assure que les trois centres d’une mini pile sont suffisamment colinéaire pour notre modèle unidimensionnel de la pile mini de l’appareil de Golgi. Tous les microscopes de lumière souffrent de l’aberration chromatique qui peut gravement altérer la position relative des centres de fluorescence rouge, vert et rouge sombre. L’aberration chromatique de systèmes de microscope est calibrée expérimentalement par imagerie 110 perles nm, qui sont marqués par fluorescence rouge, vert et rouge sombre au triple. Pour chaque image de la perle, le Centre rouge est défini comme la véritable position du talon et chromatique-déplacements des centres de verts et de rouge sombre sont équipés de fonctions polynômes de premier ordre. Centres de Golgi mini-cheminées subissent les fonctions polynomiales pour corriger les décalages-chromatique dans les canaux vert et rouge sombre.
Par le biais de GLIM, nous pouvons atteindre une résolution de ~ 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi dans des conditions normales. Ce qui est important, il fournit une méthode systématique pour cartographier quantitativement toute protéine de Golgi. GLIM peut être effectuée par des microscopes classiques, tels que grand champ ou microscopes confocaux, utilisant des protocoles communs étiquetage fluorescence. L’imagerie et traitement des données peuvent prendre aussi courts qu’une heure. Par le biais de GLIM, nous avons démontré directement la transition progressive de la cargaison sécrétrice de la cis– TRANS-latérale de l’ appareil de Golgi7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auparavant, la localisation d’une protéine de Golgi sous le microscope photonique a été principalement quantifiée par le degré de corrélation ou la superposition de l’image de la protéine et l’image d’un marqueur de Golgi de localisation connue15,16, 17. La corrélation obtenue ou coefficient de chevauchement reflète comment fermer la protéine test est le marqueur de Golgi dans l’espace. Il y a au moins trois…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier D. Stephens (Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni) pour le plasmide TPST1-EGFP ADN, ainsi que Lakshmi ngassa Govindarajan pour aider à l’optimisation du logiciel. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Conseil National de recherches médicales (NMRC/CBRG/007/2012), le ministère de l’éducation (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 et RG132/15 et AcRF niveau 2 MOE2015-T2-2-073) à L.L.
Materials
| fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads | Invitrogen | T7279 | As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope. |
| Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) | Menzel | CB00120RAC | |
| Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) | Menzel | ||
| DMEM | Capricon | DMEM-HPA-P50 | |
| Trypsin-EDTA | |||
| FBS | GE Hyclone | SV30160.03 | |
| Nocodazole | Merck | 487928 | |
| transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| transfection medium. Commercial name: OptiMEM | Invitrogen | 31985070 | |
| TPST1-EGFP | Addgene | 66617 | A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom) |
| GalT-mCherry | Made in our lab. | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 | CALBIOCHEM | 475904 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Mouse anti-GM130 | BD Biosciences | 610823 | Primary antibody for human GM130 |
| far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-21235 | Far red fluorescence conjugated secondary antibody |
References
- Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
- Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
- Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
- Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
- Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
- Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
- Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
- Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
- Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
- Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
- Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
- Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
- Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
- Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
- Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
- Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
- Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
- Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
- Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).
