使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

摘要

我们展示了一种利用荧光标记抗体的连续结合与洗脱，以单分子精度对异质纳米结构内多种分子进行成像的方法。

摘要

使用单分子定位显微镜对细胞内异质性结构进行成像，一直受到定位精度不足和多重成像能力有限的限制。通过使用荧光纳米金刚石基准标记物，我们描述了在单分子定位显微镜中实现高精度所必需的漂移校正与图像对齐步骤。此外，本文介绍了一种新的多重成像策略——madSTORM，该方法通过荧光抗体的顺序结合与洗脱，实现对同一细胞内多种分子的同时检测。我们以活化的T细胞为例，展示了madSTORM在可视化膜结合多蛋白结构——T细胞受体微簇体中不同组分空间分布的应用。同时，还讨论了madSTORM作为可视化多蛋白结构通用工具的广泛应用前景。

引言

已开发出多种超分辨率显微技术，以突破光学显微镜的衍射极限（约200 nm）。其中一类技术称为单分子定位显微技术（SMLM），包括光激活定位显微技术（PALM）和随机光学重建显微技术（STORM）。SMLM技术的共同点在于使用可在“开启”（荧光）状态和“关闭”（暗态/光开关）状态之间切换的荧光染料，从而实现对单个分子荧光信号的逐次定位^1,2,3。

由于与市售染料和显微镜的兼容性良好，直接随机光学重建显微技术（dSTORM）已成为一种被广泛采用的单分子定位显微术（SMLM）⁴。dSTORM通常可实现约10 nm的定位精度，该精度定义为计算衍射极限点扩散函数（PSF）中心位置的不确定性。然而，尽管定位算法估算出的精度较高^5,6,7，单个分子实际位置的准确测定仍受到多种因素的限制。首先，在图像采集过程中显微镜载物台的机械移动会显著增加定位精度的不确定性。由于SMLM图像是通过数千帧时间序列图像获得的，载物台在纳米尺度上的移动会严重影响最终超分辨率图像的精度

方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本实验方案中使用的多种化学试剂具有毒性且可能致癌。进行实验时，请务必采取所有适当的安全措施，包括使用工程控制设备（通风橱、手套箱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋履）。

1. 活化T细胞的多重成像

1. 使用 Alexa 647 抗体标记试剂盒将抗体与 Alexa-647（A647）染料直接偶联。按照试剂盒制造商提供的标记方案进行操作。
   注意：建议在此步骤之前将抗体溶液在1×PBS中透析，以提高抗体标记效率。
2. 将带有自旋标签的抗体在20,800 rcf下离心5分钟，收集上清液以去除聚集的抗体。
3. 荧光纳米金刚石涂层盖玻片的制备
   1. 将8孔盖玻片培养皿（见试剂/材料列表）用250 μL 0.01%多聚-L-赖氨酸（PLL）溶液在室温下孵育15分钟，吸除液体后于65 °C烘干30分钟。（烘干前无需洗涤。）
   2. 在1×PBS中配制100 nm荧光纳米金刚石（FNDs）的稀释液。在步骤1.2.7中测试不同稀释度，以确保每个视野中均有足够数量的FNDs可见（我们采用制造商提供的FNDs按1:200比例稀释）。
   3. 将稀释后的FNDs涡旋1分钟。
   4. 将FND上清液在高功率条件下超声处理30秒。
   5. 将超声处理后的FND....

结果

采用顺序洗脱和染色方法，对活化的Jurkat T细胞中的微簇及其他结构进行多重madSTORM成像图1，检查图像对齐情况）。每个伪彩色图像代表一轮通过步骤 1.1.1 至 1.3.13 获得的 madSTORM 成像结果。如前所述¹⁰应监测视野中是否存在先前未洗脱抗体的残留信号，以避免多重靶标之间的串扰。此外，由于不同抗体的洗脱效率可能存在差异，应按照从最佳到最差洗脱性能的顺序进行连续多重染色，以最大限度减少表位的空间位阻。最终的madSTORM图像在 图1 已使用第2节所述的AFC和FND基准标记对漂移和对齐进行了校正。

使用FND对来自单个独立FND（图2A，2B）和活化的Jurkat T细.......

讨论

madSTORM 中的顺序多重化、漂移校正和图像对齐步骤可实现对细胞内异质结构的精确、高通量可视化¹⁰。此外，madSTORM 避免了多色 STORM 所存在的局限性，例如色差以及非远红染料的光切换/发射性能不佳等问题^9,12。由于洗脱步骤显著降低了依次结合的抗体带来的空间位阻干扰，madSTORM 可用于对细胞样本进行多轮重复成像，突破以往技术仅能实现 6 至 10 轮多重成像的限制^9,15,21。此外，顺序洗脱与染色步骤不仅限于单分子定位显微镜（SMLM），也可应用于共聚焦显微镜、结构光照明显微镜（SIM）和双光子显微镜等其他成像技术。然而，由于 madSTORM 是一种顺序免疫染色技术，其应用受限于针对各目标分子的可用抗体。每种抗体均需经过严格验证，以确保其特异性、标记效率及可洗脱性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔盖玻片培养皿	Lab-tek	155409
0.1% 聚-L-赖氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm 荧光纳米金刚石	Adamas	Red FND
抗-CD3ε 抗体	BD Biosciences	555329
牛血清白蛋白，第五组分	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% 多聚甲醛	EMS	15712	致癌物
淡水鱼皮明胶	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 抗体标记试剂盒	Thermo Fisher	A20186
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M7154	高毒，对空气敏感
半胱胺	Sigma-Aldrich	30070	高毒
环辛四烯 98%	Sigma-Aldrich	138924	高毒，对空气敏感
10x PBS	KD Medical	RGF-3210
10x TBS	KD Medical	RGF-3385