זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין
Summary
כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.
Abstract
הנוכחות של chimerism לא שלם הוא לציין אחוז גדול של חולים לאחר השתלת מח עצם תלסמיה הגדולות או מחלה חרמשית. התבוננות זו השלכות עצומות, כפי immunomodulation טיפולית עוקבות אסטרטגיות יכול לשפר את התוצאה הקלינית. כמקובל, ניתוח המבוסס על תגובת שרשרת פולימראז של טנדם קצר חזרה משמש לזיהוי chimerism בתאי הדם נגזר התורם. עם זאת, שיטה זו מוגבל לתאים nucleated, מסוגל להבחין בין שושלות תא בודד חלופה מועדפת. אנו החלת הניתוח של טנדם קצר חזרה לזרום ממוין cytometric hematopoietic ובתאים, לעומת זה הניתוח של חזרה קצרה טנדם המתקבל שנבחר להיוות פרץ יחידה – מושבות erythroid, שניהם שנאסף העצם מח. בשיטה זו אנו מסוגלים להפגין את התפשטות שונה ואת התמיינות תאי התורם בתוך התא erythroid. טכניקה זו זכאי להשלמת ניטור הנוכחי של chimerism ב השתלת תא גזע הגדרת וייתכן לפיכך מחקרים קליניים עתידיים יישומית, מחקר תאי גזע ועיצוב של ג’ין טיפול משפטי.
Introduction
השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic (HSCT) היא גישה המרפא זמין רק עבור מגוון רחב של הפרעות גנטיות מולדת של המערכת hematopoietic, להשגת שיעורי ההישרדות ללא מחלה של למעלה מ-90% עבור אחרת מאוד בסכנה, מטופלים חיים מוגבל1. היעילות של כלי טיפולי חשוב זה הותאם על ידי הגבלת הרעילות של טרום-שלאחר ההשתלה משטרי2, אך גם על ידי התערבויות שמטרתה לקיים תפקוד שתל יציב, אשר הוא לכמת על ידי מעקב צמוד של תאי התורם-derived3,4,5.
באופן כללי, בו מלאה chimerism (CC) מרמז על התחליף הכולל של תא lymphohematopoietic על ידי התורם-derived תאים, ואילו המונח מעורב chimerism (MC) משמש כאשר תאי התורם, נמען-נגזר נוכחים בו זמנית שונות הפרופורציות. פיצול chimerism (SC) מציין קיום של מעורבות chimerism הנהוגות שושלות מתא בודד, כגון בתוך התא erythroid. בקש התאקלמות chimerism בעקבות HSCT היא קריטית, כמו זה יכול לעזור לזהות חולים חשופה התדרדרות המחלה, אסטרטגיות immunomodulatory הבאים אתחול, כמו חליטות לימפוציט התורם או הפחתת לדיכוי המערכת החיסונית טיפולים6.
פותחו מספר שיטות לניטור engraftment לאחר HSCT. Isotyping של immunoglobulins וניתוח של ציטוגנטיקה יש רגישות המסכן, מוגבלים ביכולתם לזהות פולימורפיזם7,8. המבוא של פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דגים) יכול לשפר רגישות בפיקוח chimerism לאחר HSCT, אך מוגבלת תואמים-סקס allografts9. כיום, תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) היא השיטה הנפוצה ביותר המשמשים לזיהוי chimerism והוא מבוסס על agarose קונבנציונלי-אקרילאמיד בג’ל של משתנה מספר טנדם חזרה (VNTRs) או טנדם קצר חוזר (STRs). בשימוש שגרתי PCR כמותי הוא מסוגל לזהות של אחוז קטן מאוד של תאים שיורית התורם בעקבות HSCT. המגבלה העיקרית של המחקרים עד כה הוא כי זיהוי MC מוגבל באופן כמעט בלעדי על נוכחות של תאים nucleated, יותר מאשר בוגר אריתרוציטים, כלומר תאים כי מבחינה פונקציונלית מכריע עבור חולים הושפעו פתולוגיות של המוגלובין. בחולים עם קבוצות דם שונות, אך חשוב לזכור כי ניתוח cytofluorometric הוא מסוגל לזהות chimerism בתאי דם אדומים על ידי ניצול נוגדנים חד-שבטיים מכוונים כדוריות דם אדומות אנטיגנים ABO ו- C, c, D, E ו- e10 , 11. אמצעי שונה, אבל מאוד מעניין הערכת chimerism בשושלת erythroid הוא השילוב של זרימה cytometric מיון של אבות erythroid, מבחר סוגים שונים של קדמון erythroid לפי culturing במבחני clonogenic, בעקבות ניתוח של סטראדה12. גישה זו היא היכולת לכמת כמויות יחסיות של chimerism התורם-נגד-נמען בתא erythroid, עשוי להיות מנוצל האסטרטגיה כדי לקיים את השתלת מח עצם.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי היא כדי לספק לקהל שילוב של שתי גישות ניתוח chimerism התורם/נמען בבית אבות erythroid בעקבות HSCT בחולים שטופלו על פתולוגיות של המוגלובין: 1.) תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון של hematopoietic ובתאים דגימות מח עצם שלאחריה יבוא ניתוח של חזרה טנדם קצר ו- 2.) המושבה יוצרי יחידת גידול של תאי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איטליה Regenbogen Kinderkrebshilfe.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Remove RBC |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | Sample preparation |
| 12 x 75 mm flow tubes | Falcon | 352002 | FACS sorting |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | PBS |
| Fetal calf serum | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (heat-inactivated) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025092 | Suspension buffer in FACS analysis |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Component of suspension buffer |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant human erythropoietin | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove’s Modified Dulbecco’s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | Component of Culture Medium |
| CD34+ magnetic beads | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ purification |
| Recombinant human G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Recombinant human GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant human IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Blood extraction kit | Qiagen | 51306 | DNA Isolation |
| Nanodrop ND-1000 spectra photometer | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA Quantification |
| DNAase free H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | DNA Preparation |
| AmplTaq Gold DNA Polymerase | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradient | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Size Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Genetic Analyzer | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
References
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).
- Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
- Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
- Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
- Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
- Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
- McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
- Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
- Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
- Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
- Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
- Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
- Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
- Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).
