כימות של תאי התורם-derived נדרש לעקוב אחר engraftment לאחר השתלת תא גזע בחולים עם פתולוגיות של המוגלובין. שילוב של מיון תא מבוססי cytometry זרימה המושבה היווצרות assay, לאחר מכן ניתוח של טנדם קצר חזרה ניתן להשתמש כדי להעריך את התפשטות ובידול של אבות בתוך התא erythroid.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי של התורם שיורית Erythroid ובתאים לאחר השתלת תא גזע Hematopoietic עבור חולים עם פתולוגיות של המוגלובין
במאמר זה
סיכום
תקציר
הנוכחות של chimerism לא שלם הוא לציין אחוז גדול של חולים לאחר השתלת מח עצם תלסמיה הגדולות או מחלה חרמשית. התבוננות זו השלכות עצומות, כפי immunomodulation טיפולית עוקבות אסטרטגיות יכול לשפר את התוצאה הקלינית. כמקובל, ניתוח המבוסס על תגובת שרשרת פולימראז של טנדם קצר חזרה משמש לזיהוי chimerism בתאי הדם נגזר התורם. עם זאת, שיטה זו מוגבל לתאים nucleated, מסוגל להבחין בין שושלות תא בודד חלופה מועדפת. אנו החלת הניתוח של טנדם קצר חזרה לזרום ממוין cytometric hematopoietic ובתאים, לעומת זה הניתוח של חזרה קצרה טנדם המתקבל שנבחר להיוות פרץ יחידה - מושבות erythroid, שניהם שנאסף העצם מח. בשיטה זו אנו מסוגלים להפגין את התפשטות שונה ואת התמיינות תאי התורם בתוך התא erythroid. טכניקה זו זכאי להשלמת ניטור הנוכחי של chimerism ב השתלת תא גזע הגדרת וייתכן לפיכך מחקרים קליניים עתידיים יישומית, מחקר תאי גזע ועיצוב של ג'ין טיפול משפטי.
מבוא
השתלת תא גזע allogeneic hematopoietic (HSCT) היא גישה המרפא זמין רק עבור מגוון רחב של הפרעות גנטיות מולדת של המערכת hematopoietic, להשגת שיעורי ההישרדות ללא מחלה של למעלה מ-90% עבור אחרת מאוד בסכנה, מטופלים חיים מוגבל1. היעילות של כלי טיפולי חשוב זה הותאם על ידי הגבלת הרעילות של טרום-שלאחר ההשתלה משטרי2, אך גם על ידי התערבויות שמטרתה לקיים תפקוד שתל יציב, אשר הוא לכמת על ידי מעקב צמוד של תאי התורם-derived3,4,5.
באופן כללי, בו מלאה chimerism (CC) מרמז על התחליף הכולל של תא lymphohematopoietic על ידי הת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בידוד של Hematopoietic תאים במח העצם על ידי מופעל מרובה פרמטר קרינה פלואורסצנטית מיון תא
- מכתים מדגם
- לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריכים להיות שנאספו מוכן:
- צבע מדיה עבור הכנת תאי תאי (GM), 50 מ ל חרוט צינורות
- 12 x 75 מ מ צינורות זרימה עבור צביעת תאים
- Staining מאגר: פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) + 3% עגל עוברית סרום (FCS)
- פיפטות < /l אני >
- FC לחסום ו מכתים נוגדנים (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450, BD החיים). עם השילוב fluorochrome והתאמת זניח לתוך ערוצים אחרים, אבל כל שילוב fluorochrome מתאימים אחרים אפשרי גם.
- חרוזים פיצוי (במקרה הצורך)
- מאגר ההשעיה: האנק ' s מאו....
- לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים צריכים להיות שנאספו מוכן:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרדת אבות lymphohematopoietic על-ידי מיון תא FACS
נדגים כאן תוצאות מיון האוכלוסיות תא הדרושים לניתוח סטראדה במורד הזרם. תאים במח העצם היו מוכתמים מצומדת V450 anti-CD45, FITC מצומדת אנטי-CD36, אנטי-CD34 מצומדת-APC. האוכלוסייה של עניין הוא התאים אבות (חבר הפרלמנט האירופי), nucleated erythroid מגקריוציט אחראי על הפיתוח של אריתרוציטים. תאים אלה אקספרס CD36 אך יצאו שליליות עבור אנטיגן משותף לויקוציטים CD45 (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מטרת המחקר הנוכחי היא כדי לספק לקהל שילוב של שתי גישות ניתוח chimerism התורם/נמען בבית אבות erythroid בעקבות HSCT בחולים שטופלו על פתולוגיות של המוגלובין: 1.) תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון של hematopoietic ובתאים דגימות מח עצם שלאחריה יבוא ניתוח של חזרה טנדם קצר ו- 2.) המושבה יוצרי יחידת גידול של תאים במח העצם, סיווג של המושבות בסוגים שונים של קדמון ואחריו ניתוח של חזרה קצרה טנדם. החידוש של גישה זו טמון את טכניקות של פרוטוקול כדי להעריך את התורם/המקבל chimerism במושבות בודדים.
ניתן ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי איטליה Regenbogen Kinderkrebshilfe.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | הסר RBC |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | Falcon | 14-432-22 | הכנת דגימה |
| צינורות זרימה 12 x 75 מ"מ | Falcon | 352002 FACS | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט | Gibco | 10010023 | PBS |
| סרום עגל עוברי | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (מנוטרל בחום) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 FACS-Ab | |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | ספירת תאים אוטומטית האנק |
| ' s תמיסת מלח מאוזנת | Gibco | 14025092 | מאגר מתלה בניתוח FACS |
| HEPES | Gibco | 15630080 | רכיב של מאגר מתלה |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | בלוק FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS ממיין |
| רקומביננטי אריתרופויטין אנושי | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove' s Modified Dulbecco' s בינוני | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-גלוטמין | Invitrogen | 25030-081 | רכיב של תרבית בינוני |
| CD34+ חרוזים מגנטיים | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ טיהור |
| רקומביננטי אנושי G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Recombinant Human SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| רקומביננטי אנושי GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant אנושי IL-3 | BD Bioscience | 554604 | CFU-Assay |
| Recombinant אנושי IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA ערכת מיצוי דם | Qiagen | 51306 | בידוד DNA |
| Nanodrop ND-1000 ספקטרום פוטומטר | Thermo Scientific | ND 1000 | DNA |
| כימות DNA ללא H2O | תרמו מדעי | FEREN0521 הכנת DNA | |
| AmplTaq זהב DNA פולימראז | יישומי מדעי ביו | N8080240 | PCR |
| אפנדורף שיפוע מאסטרציקלר | אפנדורף | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX גודל סטנדרטי | מדעי יישומי | 4310361 | PCR |
| 3130 מנתח גנטי | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
מקורות
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
