आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी
Summary
हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और यूवी मध्यस्थता photocrosslinking और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को मैप करते हैं ।
Abstract
कोडिंग RNAs जीन अभिव्यक्ति, क्रोमेटिन संरचना, और डीएनए की मरंमत को विनियमित सहित कई परमाणु प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ज्यादातर मामलों में, RNAs कोडिंग की कार्रवाई प्रोटीन जिसका कार्य बारी में है द्वारा मध्यस्थता है RNAs के साथ इन बातचीत द्वारा विनियमित । इसी के अनुरूप, नाभिकीय कार्यों में शामिल प्रोटीन की बढ़ती संख्या को आरएनए से बाइंड करने की सूचना मिली है और कुछ मामलों में इन प्रोटीनों की आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को अक्सर श्रमसाध्य, उंमीदवार-आधारित तरीकों के माध्यम से मैप किया गया है ।
यहां, हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों का उच्च-प्रवाह, proteome-विस्तारित निष्पक्ष पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं । पद्धति सेलुलर आरएनए में एक photoreactive uridine एनालॉग के शामिल होने पर निर्भर करता है, यूवी मध्यस्थता प्रोटीन-आरएनए crosslinking द्वारा पीछा किया, और crosslinked के भीतर आरएनए-proteome पेप्टाइड्स प्रकट करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. यद्यपि हम माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया का वर्णन, प्रोटोकॉल आसानी से प्रसंस्कृत कोशिकाओं की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
Introduction
RBR-आईडी पद्धति का उद्देश्य उपन्यास आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स (RBPs) की पहचान करना और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों (RBRs) को, आरएनए-बाइंडिंग म्यूटेंट के डिजाइन की सुविधा के लिए और जैविक और जैव रासायनिक की जांच करने के लिए, पेप्टाइड-स्तर के रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करना है । प्रोटीन-आरएनए बातचीत के कार्य.
आरएनए जैव अणुओं के बीच अद्वितीय है के रूप में यह दोनों एक आनुवंशिक जानकारी ले जाने के दूत के रूप में कार्य कर सकते हैं और भी जटिल तीन में गुना और अधिक प्रोटीन के उन लोगों के लिए सदृश रासायनिक कार्यों के साथ आयामी संरचनाओं1,2. सबूत के एक बढ़ती शरीर पता चलता है कि RNAs (ncRNAs) विभिंन जीन विनियामक और epigenetic रास्ते में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है3,4,5 और, आमतौर पर, इन विनियामक कार्य संगीत कार्यक्रम में मध्यस्थता कर रहे है एक दिया आरएनए के साथ विशेष रूप से बातचीत कि प्रोटीन के साथ. विशेष प्रासंगिकता के, प्रोटीन बातचीत का एक सेट हाल ही में तीव्रता से अध्ययन लंबे ncRNA (lncRNA) Xist के लिए पहचान की थी, कैसे इस lncRNA मध्यस्थता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के एक्स गुणसूत्र महिला कोशिकाओं में निष्क्रियता6,7 ,8. विशेष रूप से, इन Xist के कई-इंटरैक्ट प्रोटीन किसी भी विहित आरएनए-बाइंडिंग डोमेन9को शामिल नहीं करते हैं, और इसलिए उनकी आरएनए-बाइंडिंग गतिविधि को केवल उनके प्राथमिक अनुक्रम के आधार पर silico में नहीं लगाया जा सकता । यह देखते हुए कि हजारों lncRNAs किसी भी सेल10में व्यक्त कर रहे हैं, यह मान लेना उचित है कि उनमें से कई के साथ बातचीत के माध्यम से कार्य हो सकता है अभी तक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की खोज की है । एक प्रयोगात्मक रणनीति इन उपंयास RBPs की पहचान करने के लिए इसलिए बहुत ncRNAs के जैविक समारोह विदारक के कार्य की सुविधा होगी ।
पिछले प्रयास RBPs empirically की पहचान करने के लिए polyA + आरएनए सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)11,12,13,14,15के लिए युग्मित चयन पर भरोसा किया है । हालांकि इन प्रयोगों ख्यात RBPs की सूची में कई प्रोटीन जोड़ा, डिजाइन द्वारा वे केवल polyadenylated टेप करने के लिए बाध्य प्रोटीन का पता लगा सकता है । हालांकि, सबसे छोटे RNAs और कई lncRNAs polyadenylated नहीं हैं । 16 , 17 और उनके बातचीत प्रोटीन की संभावना इन प्रयोगों में याद किया गया होगा । एक ताजा अध्ययन प्रोटीन interactome डेटाबेस के लिए सीखने की मशीन लागू प्रोटीन की पहचान करने के लिए कि सह कई ज्ञात RBPs के साथ शुद्ध और पता चला कि इन आवर्तक RBP भागीदारों और आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों के अधिकारी के पास होने की संभावना थे18. हालांकि, इस दृष्टिकोण मौजूदा बड़े संपर्क डेटाबेस खनन पर निर्भर करता है और केवल प्रोटीन की पहचान कर सकते है कि सह जा सकता है ज्ञात RBPs के साथ गैर denaturing स्थितियों में शुद्ध, इस प्रकार विश्लेषण अघुलनशील से छोड़कर, झिल्ली एंबेडेड, और दुर्लभ प्रोटीन.
एक सदाशई RBP के रूप में एक प्रोटीन की पहचान अक्सर स्वचालित रूप से प्रोटीन-आरएनए बातचीत के जैविक और जैव रासायनिक समारोह के बारे में जानकारी नहीं निकलेगा । इस बिंदु को संबोधित करने के लिए, यह आम तौर पर वांछनीय है प्रोटीन डोमेन और एमिनो एसिड बातचीत में शामिल अवशेषों की पहचान इतना है कि विशिष्ट म्यूटेंट के लिए प्रत्येक उपंयास के संदर्भ में आरएनए बाध्यकारी समारोह का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है RBP19, 20. हमारे समूह और अंय लोगों द्वारा पिछले प्रयासों संयोजक प्रोटीन टुकड़े और हटाने म्यूटेंट का इस्तेमाल किया है आरएनए बंधन क्षेत्रों की पहचान (RBRs)19,20,21,22; हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण उच्च प्रवाह विश्लेषण के साथ श्रम गहन और असंगत हैं । हाल ही में, एक अध्ययन में एक उच्च प्रवाह वाले फैशन में आरएनए-बाइंडिंग गतिविधियों को जन स्पेक्ट्रोमेट्री23का उपयोग करते हुए मैप करने के लिए एक प्रायोगिक कार्यनीति बताई गई है; हालांकि, इस दृष्टिकोण एक डबल polyA + आरएनए चयन पर भरोसा है, और इस तरह RBP पहचान दृष्टिकोण ऊपर वर्णित के रूप में एक ही सीमाओं किया ।
हमने एक तकनीक विकसित की, जो कि आरएनए बाइंडिंग क्षेत्र पहचान (RBR-ID) है, जो प्रोटीन-आरएनए photocrosslinking और मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का शोषण करता है ताकि प्रोटीन और प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान की जा सके जो बिना जीवित कोशिकाओं में आरएनए के साथ इंटरैक्ट कर रहे हैं आरएनए polyadenylation स्थिति पर धारणा, इस प्रकार polyA-RNAs24के लिए बाध्य RBPs सहित । इसके अलावा, इस विधि crosslinking पर विशेष रूप से निर्भर करता है और प्रोटीन घुलनशीलता या पहुंच पर कोई आवश्यकताओं है और इस तरह झिल्ली (जैसे परमाणु लिफाफा) या खराब घुलनशील डिब्बों के भीतर आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों को मैप करने के लिए उपयुक्त है ( परमाणु मैट्रिक्स उदा ) । हम प्रायोगिक चरणों का वर्णन करने के लिए RBR माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs) के नाभिक के लिए आईडी लेकिन मामूली संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक किस्म के लिए उपयुक्त होना चाहिए, बशर्ते कि वे कुशलतापूर्वक संस्कृति से 4SU को शामिल कर सकते है मध्यम.
Protocol
1. mESCs की संस्कृति और विस्तार
नोट: माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं और जल्दी से अपने तेजी से साइकिल चालन समय के लिए धन्यवाद जैव रासायनिक प्रयोगों द्वारा आवश्यक बड?…
Representative Results
Discussion
हम mESCs में RBR आईडी प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन और, उचित संशोधनों के साथ, आरएनए में 4SU को शामिल कर सकते हैं कि किसी भी सेल में. अंय सेल प्रकार के दृष्टिकोण के अनुकूलन की आवश्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. Searle विद्वानों कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, W.W. स्मिथ फाउंडेशन (C1404), और सिक्का फाउंडेशन के मार्च (1-वित्तीय-15-344) । बी. ए. जी NIH अनुदान R01GM110174 और NIH R01AI118891, साथ ही DOD अनुदान BC123187P1 से समर्थन स्वीकार करता है. आर.-टी. NIH प्रशिक्षण अनुदान T32GM008216 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
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