We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteïnen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Noncoding RNAs spelen een belangrijke rol in verschillende nucleaire processen, waaronder regulering van de expressie van genen, structuur van de chromatine en DNA-herstel. In de meeste gevallen is het optreden van noncoding RNAs gemedieerd door eiwitten waarvan de functies zijn op hun beurt weer gereguleerd door deze interacties met noncoding RNAs. In overeenstemming met dit, een groeiend aantal eiwitten die betrokken zijn in nucleaire functies hebben gemeld RNA binden en in enkele gevallen de RNA-bindende regio's van deze proteïnen zijn toegewezen, vaak door middel van moeizame, kandidaat-gebaseerde methoden.
Wij rapporteren hier een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een hoge-doorvoer, Proteoom bestrijkende onbevooroordeelde identificatie van RNA-bindende proteïnen en hun RNA-bindende regio's. De methodologie steunt op de opneming van een fotoreactief uridine analoge in de cellulaire RNA, gevolgd door UV-gemedieerde eiwit-RNA crosslinking en spectrometrische analyse te onthullen van RNA-kruisverwijzende peptiden binnen het proteoom. Hoewel we de procedure voor de muis embryonale stamcellen beschrijven, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan een verscheidenheid van gekweekte cellen.
Inleiding
Het doel van de methode van de RBR-ID is het identificeren van de roman RNA-bindende proteïnen (RBPs) en hun RNA-bindende regio's (RBRs) kaart met peptide tabelniveau resolutie ter vergemakkelijking van het ontwerp van RNA-bindende mutanten en het onderzoek van de biologische en biochemische functies van eiwitten-RNA interacties.
RNA is uniek onder biomoleculen zoals het kan fungeren als een boodschapper uitvoering van genetische informatie én ook in complexe driedimensionale structuren met biochemische functies meer verwant aan die van eiwitten1,2 vouwen. Een groeiende hoeveelheid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. cultuur en uitbreiding van mESCs
Opmerking: muis embryonale stamcellen zijn eenvoudig te cultuur en kan snel worden uitgebreid tot de grote aantallen voorgeschreven biochemische experimenten dankzij hun snelle fietsen tijd. Gezonde mESCs verdubbelen elk 12 h.
- Uitvouwen mESCs naar het gewenste nummer op gelatinized platen in mESC medium (zie hieronder) in een incubator weefselkweek bewaard bij 37 ° C, 5% CO 2, en > 95% vochtigheid.
Opmerking: Genoeg platen moeten worden voorbereid voor de biologische replicatieonderzoeken 3-5 voor de + 4SU monster en de controle van de - 4SU. Een 10-cm plaat (dat wil ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 toont de workflow van de RBR-ID. Als gevolg van de relatief lage crosslinking efficiëntie van deze techniek is het zeer belangrijk dat zowel het niveau van de uitputting en de consistentie van het waargenomen effect (P -waarde) over biologische wordt gerepliceerd. Figuur 2 toont een vulkaan plot van RBR-ID resultaat. Peptiden dat RNA erkenning motief (SRM) domein overlapt geven zeer consistente uitputting graad........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We beschrijven een gedetailleerde experimenteel protocol standaardinteracties RBR-ID in mESCs en met adequate wijzigingen, in een willekeurige cel die 4SU in RNA kunt opnemen. Andere celtypes voorschrijven optimalisatie van de aanpak om ervoor te zorgen een voldoende signaal / ruisverhouding. Bovendien, terwijl het protocol hierin richt zich op de behandeling van nucleaire RBPs beschreven, moet de technologie van de RBR-ID worden gemakkelijk aangepast aan verschillende cellulaire compartimenten, zoals het cytosol of spec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
R.B. werd ondersteund door het programma van de geleerden Searle, de W.W. Smith Foundation (C1404) en de March of Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G erkent ondersteuning van NIH grants R01GM110174 en NIH R01AI118891, en DOD verlenen BC123187P1. R.W.-T. werd gesteund door de NIH opleiding grant T32GM008216.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, US oorsprong | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine oplossing 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicilline-Streptomycine oplossing | Sigma | P0781 | |
| MEM Niet-essentiële aminozuur oplossing (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemie Remmende Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatine oplossing, 2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Fenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commerciële vorm van octyl-fenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsine, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extractie disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 omgekeerde - fase hars | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | Hoge zuiverheid nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | bijgewerkt met FB505110 |
| HPLC-kwaliteit acetonitril | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC-kwaliteit water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonaat | Sigma | A6141 | |
| Azijnzuur | Sigma | 49199 | |
| Mierenzuur | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing materiaal voor HPLC kolom |
| Capillair voor nano kolom (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Kan chromatografische uitlijning van meerdere MS runs uitvoeren |
Referenties
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang,....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
