Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder
Summary
Vi beskriver en protokoll for å identifisere RNA-bindende proteiner og tilordne sine RNA-bindende regioner i levende celler ved hjelp av UV-mediert photocrosslinking og massespektrometri.
Abstract
Noncoding RNAs spille viktige roller i flere kjernefysisk prosessene, inkludert regulere genuttrykk, chromatin struktur og DNA-reparasjon. I de fleste tilfeller er av noncoding RNAs formidlet av proteiner med funksjoner som igjen er regulert av disse interaksjoner med noncoding RNAs. I samsvar med dette, et økende antall proteiner involvert i kjernefysiske funksjoner har blitt rapportert å binde RNA og i noen tilfeller regionene RNA-binding av disse proteinene er tilordnet, ofte gjennom arbeidskrevende, kandidat-baserte metoder.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll for å utføre en høy gjennomstrømning og proteom hele objektiv identifikasjon av RNA-bindende proteiner og deres RNA-bindende områder. Metodene er avhengig av inkorporering av en photoreactive uridine analog i den cellulære RNA, etterfulgt av UV-mediert protein-RNA crosslinking og massespektrometri analyser å avsløre RNA-krysskoblet peptider i proteom. Selv om vi beskriver fremgangsmåten for mus embryonale stamceller, bør protokollen være lett tilpasses en rekke kulturperler celler.
Introduction
Formålet med metoden RBR-ID er å identifisere romanen RNA-bindende proteiner (RBPs) og kart sine RNA-bindende regioner (RBRs) med peptid nivå oppløsning til rette for design av RNA-bindende mutanter og undersøkelsen av biologiske og biokjemiske funksjoner av protein-RNA interaksjoner.
RNA er unik blant biomolecules som det kan både fungere som en budbringer bærer genetisk informasjon og også kaste i komplekse tredimensjonale strukturer biokjemiske funksjoner mer lik de av proteiner1,2. En voksende mengde bevis antyder at noncoding RNAs (ncRNAs) spille en viktig rolle i ulike genet regulatoriske og epigenetic veier3,4,5 , og vanligvis disse regulatoriske funksjonene er formidlet i konsert med proteiner som samhandler med en gitt RNA. Av spesiell relevans, ble et sett av samspill proteiner nylig oppdaget for intenst studerte lang ncRNA (lncRNA) Xist, gir verdifull innsikt i hvordan dette lncRNA formidler X-chromosome inaktivering i kvinnelige celler6,7 ,8. Spesielt, flere av disse Xist-samspill proteiner inneholder ikke noen kanoniske RNA-bindende domener9, og derfor deres RNA-binding aktivitet kunne ikke forventet i sili basert på deres primære sekvens alene. Tatt i betraktning at tusenvis av lncRNAs er uttrykt i en gitt celle10, er det rimelig å anta at mange av dem kan handle via interaksjon med ennå ikke oppdaget RNA-bindende proteiner (RBPs). En eksperimentell strategi å identifisere disse romanen RBPs derfor stor grad vil lette oppgaven med å dissekere den biologiske funksjonen for ncRNAs.
Tidligere forsøk på å identifisere RBPs empirisk avhengig polyA + RNA utvalg kombinert til massespektrometri (MS),11,,12,,13,,14,,15. Selv om disse eksperimentene lagt mange proteiner i listen over mulige RBPs, av design de finner bare proteiner bundet til polyadenylated utskrifter. Men er de fleste små RNAs og mange lncRNAs ikke polyadenylated. 16 , 17 og deres samspill proteiner ville sikkert ha vært savnet i disse eksperimentene. En fersk studie brukt maskinlæring protein-protein interactome databaser å identifisere proteiner som co renset med flere kjente RBPs og viste at disse tilbakevendende RBP partnere var mer sannsynlig å ha RNA-bindende aktiviteter18. Men denne tilnærmingen avhengig gruvedrift eksisterende store interaksjon databaser og kan kun identifisere proteiner som kan være co renset i ikke-denaturing forhold med kjente RBPs, dermed unntatt fra analyse uløselig membran-embedded og knappe proteiner.
Identifikasjon av et protein som en bona fide RBP ofte gir ikke informasjon om biologisk og/eller biokjemiske funksjonen av protein-RNA samhandlingen automatisk. For å løse dette punktet, er det vanligvis ønskelig å identifisere protein domene og aminosyre rester i samhandlingen slik at bestemte mutanter kan utformes til å teste funksjonen av RNA binding i forbindelse med hver romanen RBP19, 20. forrige innsats av vår gruppe og andre har brukt rekombinante proteinfragmenter og sletting mutanter for å identifisere RNA bindende områder (RBRs)19,20,21,22; men er disse arbeidskrevende og inkompatibel med høy gjennomstrømming analyser. Flere nylig, en studie beskrevet en eksperimentell strategi for å tilordne RNA-bindende aktiviteter i en høy gjennomstrømming mote bruker massespektrometri23; men denne tilnærmingen avhengig av et dobbelt polyA + RNA utvalg, og dermed bar de samme begrensningene som RBP identifikasjon nærmer seg beskrevet ovenfor.
Vi utviklet en teknikk, kalt RNA bindende område-IDen RBR-, som utnytter protein-RNA photocrosslinking og kvantitative massespektrometri å identifisere proteiner og protein regioner samarbeidsstil RNA i levende celler uten å gjøre Forutsetningen om RNA polyadenylation status, dermed inkludert RBPs bundet til polyA-RNAs24. Videre denne metoden avhenger utelukkende på crosslinking og har ingen krav på protein løselighet eller tilgjengelighet og er derfor egnet til å tilordne RNA-bindende aktiviteter innen membraner (f.eks den kjernefysiske konvolutten) eller dårlig løselig rom ( f.eks kjernefysiske matrix). Beskriver vi eksperimentelle trinnene for å utføre RBR-ID for kjerner i mus embryonale stamceller (mESCs), men med mindre modifikasjoner denne protokollen bør være egnet for en rekke celletyper, forutsatt at de kan effektivt innlemme 4SU fra kulturen medium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en detaljert eksperimentelle protokoll for å utføre RBR-ID i mESCs, og med riktige modifikasjoner, i en celle som kan innlemme 4SU i RNA. Andre celletyper krever optimalisering av tilnærming å sikre et tilstrekkelig signal til støyforhold. I tillegg, mens protokollen beskrevet heri fokuserer på undersøkelse av kjernefysiske RBPs, bør RBR-ID-teknologi være lett tilpasses forskjellige mobilnettet avdelinger, som stoffer eller bestemte organeller, ved bruk av forskjellige fraksjoneres strategier. Param…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.B. ble støttet av den Searle Scholars Program, ww Smith Foundation (C1404) og mars Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G anerkjenner støtte fra NIH gir R01GM110174 og NIH R01AI118891, og DOD gi BC123187P1. R.W.-T. ble støttet av NIH trening grant T32GM008216.
Materials
| KnockOut DMEM | Fisher Scientific | 10829018 | |
| Fetal bovine serum, qualified, US origin | Fisher Scientific | 26140079 | |
| L-Glutamine solution 200 mM | Sigma | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma | P0781 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1106 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| PD0325901 | Sigma | PZ0162 | |
| Gelatin solution,2% in water | Sigma | G1393 | |
| 4-thiouridine | Sigma | T4509 | 50 mM stock in water |
| Spectrolinker XL-1500 | Fisher Scientific | 11-992-90 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | 78830 | |
| IGEPAL CO-630 | Sigma | 542334 | Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent |
| Iodoacetamide | Sigma | I6125 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 | |
| Empore solid phase extraction disk | 3M | 66883 | |
| OLIGO R3 Reversed – Phase Resin | Fisher Scientific | 1133903 | |
| Benzonase | Sigma | E8263 | High purity nuclease |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fisher Scientific | discontinued | updated with FB505110 |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6 4 | |
| TFA | Fisher Scientific | A11650 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Acetic Acid | Sigma | 49199 | |
| Formic Acid | Sigma | F0507 | |
| ReproSil-Pur 18-AQ | Dr. Maisch GmbH HPLC | r13.aq.0003 | Packing material for HPLC column |
| Capillary for nano columns (75 µm) | Molex | 1068150017 | |
| MaxQuant software | Max Planck Institute for Biochemistry | Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs |
References
- Bonasio, R., Shiekhattar, R. Regulation of transcription by long noncoding RNAs. Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).
- Rinn, J. L., Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).
- Goff, L. A., Rinn, J. L. Linking RNA biology to lncRNAs. Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).
- Holoch, D., Moazed, D. RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression. Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Kwon, S. C., et al. The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).
- Beckmann, B. M., et al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat Commun. 6, 10127 (2015).
- Conrad, T., et al. Serial interactome capture of the human cell nucleus. Nat Commun. 7, 11212 (2016).
- Wilusz, J. E., et al. A triple helix stabilizes the 3′ ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails. Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162 (5), 948-959 (2015).
- Brannan, K. W., et al. SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes. Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).
- Bonasio, R., et al. Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes. Elife. 3, e02637 (2014).
- Kaneko, S., et al. Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin. Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).
- Kaneko, S., et al. Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA. Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).
- Saldana-Meyer, R., et al. CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53. Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).
- Castello, A., et al. Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells. Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).
- He, C., et al. High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells. Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).
- Favre, A., et al. 4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
- Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5′ splice site recognition. Elife. 4, (2015).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. J Vis Exp. (41), (2010).
