Chromatin Immunoprecipitation के लिए क्रॉस-लिंक किए गए स्केलेटल स्नायु से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक तैयार करने का एक निस्पंदन-आधारित पद्धति
Summary
हम क्रॉस-लिंक्ड माउस कंकाल की मांसपेशियों से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक निस्पंदन-आधारित प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिसमें हमने अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन की आवश्यकता को हटा दिया, जिससे इसे आसानी से लागू किया जा सके। हम बताते हैं कि नाभिक से तैयार क्रोमेटिन क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन और संभावित क्रोमैटिन इम्युनोपेप्रिडीएक्शन सिकेंजिंग अध्ययन के लिए उपयुक्त है।
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (चीप) क्रोमेटिन डीएनए के लिए प्रोटीन बाध्यकारी निर्धारित करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। फाइबर समृद्ध कंकाल की मांसपेशियों, हालांकि, myofibrils के कम से कम प्रदूषण के साथ उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक के अलगाव में तकनीकी कठिनाई के कारण चिप के लिए एक चुनौती रही है। पिछला प्रोटोकॉल ने क्रॉस-लिंकिंग से पहले नाभिक को शुद्ध करने का प्रयास किया है, जो लंबे समय तक नाभिक तैयारी प्रक्रिया के दौरान बदलते डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का जोखिम उठाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम पहले चूहों से एकत्र कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों को क्रॉस-लिंक करते थे, और ऊतकों को कामा और सोनिक किया गया था। चूंकि हमने पाया कि अल्ट्रेंट्र्रिफ्यूगेशन क्रॉस-लिंक की गई मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग करके मायोफिब्रिल से नाभिक को अलग करने में सक्षम नहीं था, हमने महत्वपूर्ण मायोफिब्रिल प्रदूषण रहित रहित उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक प्राप्त करने के लिए एक अनुक्रमिक निस्पंदन प्रक्रिया तैयार की थी। हमने बाद में एक अल्ट्रासोनैटरेटर का उपयोग करके क्रोमेटिन तैयार किया, और एंटी-बीएमएएल 1 एंटीबॉडी के साथ चीप एशेज से पता चला कि मजबूत सर्कैडियन बाइंडिंगजीन प्रमोटरों को लक्षित करने के लिए BMAL1 का पैटर्न यह निस्पंदन प्रोटोकॉल, सर्कैडियन और अन्य समय-संवेदी अध्ययनों के लिए संगत नमूना प्रसंस्करण की अनुमति देने वाले क्रॉस-लिंक्ड कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों से उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए आसानी से लागू विधि का गठन करता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के साथ संयोजन में, हमारी पद्धति को कंकाल की मांसपेशी समारोह पर ध्यान केंद्रित करने वाले विभिन्न तंत्रिकी और जीनोमिक अध्ययनों के लिए तैनात किया जा सकता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान और व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। मल्टी-न्यूक्लेयटेड मांसपेशी फाइबर में मायोफिब्रिल होते हैं, जहां एक्टिन और मायोसिन फंक्शनल यूनिटों को बनाते हैं, जिन्हें सर्कमर्स नामक सिकुड़ी शक्ति उत्पन्न होती है। कंकाल की मांसपेशियों में शरीर का सबसे बड़ा चयापचय अंग भी होता है-> 80% प्रत्यावर्ती ग्लूकोज सेवन के लिए और इंसुलिन प्रतिक्रिया और चयापचय होमोस्टैस 1 , 2 को विनियमित करने के लिए। मांसपेशी शरीर विज्ञान और चयापचय को सर्कैडियन घड़ी, एक आंतरिक जैविक टाइमर 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा बारीकी से नियंत्रित किया जाता है। उदाहरण के लिए, कोर सर्कैडियन घड़ी के घटकों में से एक, बमल 1 के कंकाल की मांसपेशी-विशिष्ट विलोपन, इंसुलिन प्रतिरोध और कंकाल की मांसपेशियों में कम ग्लूकोज तेज हो गया और जानवरों को टाइप 2 डायबिटीज़ 7 विकसित करने के लिए पाए गए। मैंइसके अलावा, कंकाल की मांसपेशी को भी अंतःस्रावी अंग 8 के रूप में सराहना किया जा रहा है, प्रणालीगत चयापचय और फिजियोलॉजी को नियंत्रित करने के लिए माइोकिन्स स्रावित करना। कंकाल की मांसपेशियों में इन नियामक कार्यों को पूरी तरह से समझने के लिए यांत्रिक अध्ययनों की आवश्यकता होती है।
चिप डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के प्रमोटर भर्ती को चित्रित करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। चिप को प्रारंभिक रूप से क्रोमैटीन डीएनए 9 , 10 पर न्यूक्लियोओसोम संगठन की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था। बाद में विभिन्न प्रकार के तरीकों से क्रॉस-लिंक प्रोटीन और क्रोमेटिन डीएनए को फार्मलाडिहाइड, डायमिथाइल सल्फेट या पराबैंगनी विकिरण (यूवी) 11 , 12 का उपयोग कर बताया गया है । फार्मलाडहेड क्रॉस-लिंकिंग सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाता है, क्रोमेटिन संरचना का संरक्षण और डीएनए प्रोटीन इंटरैक्शन 9 , 13 , 14 है । क्रॉस-लिंक किए गए क्रोमेटमें बायोडाईटेशन द्वारा दबाने पर लगाया जाता है और ब्याज 15 , 16 के विशेष डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षी हो जाता है। हाल के वर्षों में चिप-अनुक्रमण (चीप-सीईसी), एनजीएस के साथ चिप का संयोजन करने वाला एक तरीका विकसित किया गया है, जिसे जीनोम-चौड़ा ट्रांसक्रिप्शन कारक बाध्यकारी 17 से पूछताछ करने के लिए विकसित किया गया है, और कुछ मामलों में एक समय के पाठ्यक्रम 18 , 1 9 , 20 । उदाहरण के लिए, सर्कैडियन चिप-सेक के अध्ययन ने सर्कैडियन घड़ी घटकों और हिस्टोन मार्करों के जीनोमिक बाइंडिंग का एक बहुत ही ऑर्केस्ट्रेटेड अनुक्रम प्रकट किया है, जो पूरे ~ 24 घंटे के सर्कैडियन चक्र 18 में अस्थायी रूप से सटीक जीन अभिव्यक्ति को चलाता है।
सबसे अधिक उपलब्ध चिप प्रोटोकॉल को मुलायम ऊतकों ( जैसे यकृत, मस्तिष्क, आदि ) के लिए डिज़ाइन किया गया है, और बहुत कुछ को कंकाल सहित कठिन ऊतकों के लिए प्रकाशित किया गया हैताल मांसपेशियों फाइबर के समृद्ध कंकाल की मांसपेशियों को होमोजिनायज करना और उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक 21 को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, खासकर चिप प्रयोगों के लिए जो क्रॉस-लिंकिंग की आवश्यकता होती है। हाल ही में मांसपेशियों के चिप्प अध्ययन में 22 , उपग्रह कोशिकाओं को माईफिबर्स से अलग किया गया था, और ऊतक पाचन को शामिल करने के लिए लंबे समय तक प्रक्रिया के माध्यम से नाभिक दोनों कोशिकाओं से तैयार किए गए थे। पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लगभग तीन घंटे लग गए, इससे पहले फॉर्मलाडहाइड क्रॉस-लिंकिंग पृथक नाभिक पर किया गया था। हालांकि यह प्रक्रिया क्रॉस-लिंकिंग मांसपेशी फाइबर से परहेज करती है, जो मांसपेशियों के ऊतकों को कुशल होमोजिनायझेशन के लिए और अधिक अपवर्तक बनाता है, और उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक का उत्पादन करने में सक्षम था, ऊतक संग्रह से नाभिक क्रॉस-लिंकिंग के लिए महत्वपूर्ण समय-समय पर डीएनए को बदलने का जोखिम होता है प्रोटीन इंटरैक्शन इसके विपरीत, अधिकांश अध्ययनों ने वास्तविक समय डीएनए प्रोटीइ को सुरक्षित रखने के लिए प्रयोगात्मक उपचार या ऊतक संग्रह के तुरंत बाद क्रॉस-लिंकिंग कियाएन बाइंडिंग 12 क्रॉस-लिंकिंग से पहले नाभिक अलगाव का दूसरा दोष यह है कि यह समय-संवेदनशील अनुप्रयोगों को रोकता है जैसे सर्कैडियन नमूना संग्रह, जो आमतौर पर 3 – 4 एच अंतराल पर होता है। नाभिक को क्रॉस-लिंक किए बिना, अलगाव को विच्छेदन के तुरंत बाद आगे बढ़ने की आवश्यकता होती है, जबकि पूरे समय के पाठ्यक्रम के पूरा होने के बाद क्रॉस-लिंक किए गए नमूनों को एक साथ संसाधित किया जा सकता है, इस प्रकार इसने अधिक प्रयोगात्मक स्थिरता सुनिश्चित की है।
अनसर्लिंक किए गए कंकाल की पेशी से नाभिक अलगाव के अन्य प्रोटोकॉल भी सूचित किये गये हैं। दो अध्ययनों में उर्वरक अवरोष्ठता के उपयोग के लिए नाभिक को उर्वरित उर्वरकों और सेल मलबे 23 , 24 से अलग करने के लिए वर्णित किया गया है। जबकि सुक्रोज़ या कोलाइडयन ग्रेडिएंट अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन अनसर्लिंकित मांसपेशियों के ऊतकों के साथ प्रभावी है, हमारे प्रयोगों से पता चला है कि क्रॉस-लिंकिंग के बाद, ग्रेडियेंट अल्ट्रेंट्रिफ्यूगेशन सेल डी से नाभिक को अलग करने में असफल रहा हैढाल पर एब्रिस
हमने इसलिए क्रॉस-लिंक्ड माउस कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का उपयोग करते हुए उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने की प्रक्रिया विकसित की है। ग्रिडिएन्ट अल्ट्रेंसिफिग्यूशन के बजाय, हमने मलबे से नाभिक को प्रभावी रूप से अलग करने के लिए एक सीरियल निस्पंदन विधि तैयार की थी। अल्ट्रासॉनिकेशन के बाद, चिप अध्ययनों के लिए क्रोमेटिन के नमूनों को सफलतापूर्वक लागू किया गया, जिसमें प्रमोटर्स को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी बीएमएमएल 1 प्रोटीन के सर्कैडियन पैटर्न दिखाए गए। हमारी विधि मांसपेशियों के ऊतकों के विभिन्न यंत्रवत् अध्ययनों के लिए मोटे तौर पर लागू हो सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम एक मजबूत विधि का वर्णन करते हैं जहां उच्च-गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए कंकाल से जुड़ी कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों का इस्तेमाल किया गया था। मलबे से नाभिक को प्रभावी ढंग से अलग करने के …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
उपयोगी सलाह के लिए हम कैरन एस्सार, नोबुया कोइक और नोहॉन पार्क का धन्यवाद करते हैं इस काम को एनआईएच / एनआईजीएमएस (आर -101 जीएम 114424) एस-एचवाई और रॉबर्ट ए। वेल्च फाउंडेशन (एयू -1731) और एनआईएच / एनआईए (आरएपीएजीए 080828) को जेसीसी से समर्थित किया गया था।
Materials
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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