נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג
במאמר זה
סיכום
תקציר
במשך שנים, היו הבחנות בין סוגי סיבי שריר השלד הטוב דמיינו ידי מכתימה צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase. לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סוג סיבים. מסוג I, הקלד IIA, הקלד IIX ו סיבים מסוג IIB עכשיו יכול להיות מזוהה עם דיוק בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC; עם זאת, ניתוח ידנית של נתונים אלו יכול להיות איטי ולא גמור מייגע. בהקשר זה, הערכה מהירה, מדויקת של סיבים מסוג הרכב מורפולוגיה הוא כלי מאוד רצוי. כאן, אנו מציגים עבור המדינה-of-the-art נוגדן של MyHCs בסעיפים קפוא המתקבל העכבר שריר hindlimb בהופעה עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן שמאיץ את ניתוח סיבים מסוג וסיבים מורפולוגיה של פרוטוקול. כצפוי, שריר הסוליה מוצג צביעת עבור מסוג I ו סיבים IIA, אך לא עבור סוג IIX או סוג סיבי IIB. מצד שני, שריר השוקה הקדמי היה ברובו מורכב סוג IIX ו- type IIB סיבים, חלק קטן של סוג IIA סיבים, מעט או ללא סוג סיבים. מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות לצורך מדידת היבטים שונים של סיבים מורפולוגיה (קרי, שטח חתך הרוחב (CSA), קוטר Feret מקסימלית וללא מינימלי). הערכים שהתקבלו עבור פרמטרים אלו הושוו עם ערכים שהושג באופן ידני. אין הבדלים משמעותיים נצפו בין בכל מצב של ניתוח לגבי CSA, קוטר Feret מינימלי או מקסימלי (כל p > 0.05), המציין את הדיוק של שיטת שלנו. לפיכך, פרוטוקול הניתוח שלנו immunostaining ניתן להחיל את החקירה של השפעות על השריר הרכב דגמים רבים של הזדקנות, מיופתיה.
מבוא
זה כבר ידוע מזה זמן כי שרירי השלד מורכב של סיבי יחיד של סוגים רבים1. בתחילה, שתי קבוצות של סיבי מאופיינים על סמך מאפייניהם כויץ ו בשם, בהתאם, איטי עווית (סוג), במהירות עווית (סוג II). קטגוריות אלה היו מכובדים נוספים על בסיס סיבים חילוף החומרים. מאז סוג סיבים עשירים המיטוכונדריה, מסתמך על מטבוליזם חמצוני, הם היו הובהר על-ידי nicotinamide אדנין dinucleotide robustly חיובי-tetrazolium רדוקטאז (NADH-TR) diaphorase2 או succinate דהידרוגנאז (SDH)3 מכתים. לעומת זאת, סוג II סיבי הציג פחותה מעלות משתנה של NADH-TR diaphorase או SDH מכתים, חולקו לשתי תת-קבוצות במהירות עווית (מסוג IIA ו- IIB) במידה מסוימת בגס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בכל ההליכים הכרוכים עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו-Anschutz קמפוס מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (91813(05)1D).
1. יום 1: ראשי (1°) Immunostaining עם חסימת שור אלבומין (BSA)
- Air-dry קפוא מקטעי שריר hindlimb העכבר (למשל, השוקתי הקדמי, הסוליה) רכוב על שקופיות טעונה ~ 30 דקות 11. לשרטט גבול סביב הסעיפים באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול.
- המקום ~ µL 250 תמיסת מלח 5% BSA/פוספט buffered (BSA/PBS) בכל שקופית כדי לחסום נוגדן ספציפי שאינו מחייב. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר במשך ה 1
- תוך חסימת, להכין 1:50 דילולים של הנוגדן 1° supernatant ב 5% BSA/PBS (כל הם נוגדנים חד-ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השרירים Hindlimb (קרי, השוקתי הקדמי, הסוליה) גזור מן עכבר C57BL/6 זכרים בגיל לא ידוע היו פלאש קפוא ידי שוקע כייר פלסטיק המכיל את השריר ב אוקטובר במתחם איזופנטאן מקורר חנקן נוזלי. לאחר מכן, משתמש cryotome, 8-10 מיקרומטר מקטעים טורי היו ב-20 ° C גזורה הועבר שקופיות זכוכית שונים מפרוטונים שמטענם12.
בחרנו השוקתי הקדמי, הסוליה כי אלה השרירים מורכבים בעיקר סיבי fast - ו איטי עווית, בהתאמה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
. הנה, סיפקנו כיוון שימושי לצורך זיהוי סוגי סיבי שריר השלד. בעשותו כן, נתאר באלגוריתם הרומן לניתוח הנתונים.
מאז התוצאות שלנו במידה רבה לאשר את אלה של דוחות קודמים5,8,10 , משקפים משלנו מדידות ידניות, האלגוריתם מופיע לדייק. ובכל זאת, נתקלנו כמה מלכודות ניסיוני נדירים כולל גבולות ברורים סיבים הנובע חלוקתה החפץ. ניתן למזער את ההשפעה של לכלוכים אלה באמצעות חלוקתה זהירה ובחינה על המשמר של המקטע מעובד לפני נ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש אינטרסים סותרים לא לחשוף.
תודות
. אנחנו אסירי תודה קרן Boettcher, האגודה נוירודגנרטיביות (#17-II-344) על תמיכתם של מחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סרום בקר אלבומין | סיגמא אולדריץ' | A9418-100G | 5% |
| במעבדת מכשירים | מדעיים של PBS מחסום הידרופובי | 9804-02 | |
| מיקרוסקופ שקופיות | גלובוס מדעי | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| לק לציפורניים | לוריאל | ||
| ניקון אקליפס TE-200 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך וברייטפילד | הופסק SPOT | ||
| 1:50 | |||
| נוגדנים ראשוניים | בנק היברידומה באוניברסיטת איווה | עכבר חד שבטי IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 | מחקרי התפתחות נוגדנים ראשוניים בנק היברידומה באוניברסיטת איווה | עכבר חד שבטי IgGM; 1:50 | |
| נוגדנים ראשוניים | בנק היברידומה באוניברסיטת איווה | עכבר חד שבטי IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | נגד עכבר; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | עז נגד עכבר; 1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | עז נגד עכבר; 1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| איזופנטן | פישר סיינטיפיק | O3551-4 | מגניב עם חנקן liguid |
| PBS | פישר ביוריאגנטים | BP665-1 | 10x, מדלל ל-1x |
| מגבוני קים | קימברלי-קלארק | 06-666A |
מקורות
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-media....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
