マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

サマリー

骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

要約

長年、骨格筋線維のタイプ間の区別されたミオシン ATPase 染色による視覚化に最適。最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維型の細かい識別子として浮上しています。タイプ I、IIA、IIX を入力を入力し、タイプ IIB 線維は、MyHC プロファイルに基づく精度で今識別できます。ただし、これらのデータの手動解析が遅いと右下をすることができます退屈。この点では、繊維の種類組成と形態の迅速で正確な評価は非常に望ましいツールです。ここでは、最新の免疫組織化学染色繊維の種類や繊維の形態の分析を加速する新たな半自動アルゴリズムとのコンサートでマウスの後肢筋から得られた凍結切片における MyHCs のためのプロトコルを提案する.ヒラメ筋が表示されます染色タイプ I およびタイプ IIA 線維、予想通り、ではなく、IIX またはタイプ IIB 線維。その一方で、前脛骨筋 IIX とタイプ IIB 線維、タイプ IIA 線維のごく一部の主にで構成されていた、またはほとんどないタイプ I 線維。いくつかのイメージの変換は、繊維形態を (すなわち、断面積 (CSA)、極大値と極小のフェレー径) のさまざまな側面を測定する目的について確率マップを生成する使用されました。これらのパラメーターが手動で得られた値と比較し、得られた値。CSA、最大または最小のフェレー径に関して解析のいずれかのモード間に有意差は認められなかった (すべてp > 0.05)、提案手法の精度を示します。したがって、私たちの免疫染色解析プロトコルは高齢化とミオパチーの多くのモデルで筋肉の組成に及ぼす影響の調査に適用できます。

概要

それは、骨格筋は多くのタイプ¹の単繊維から成るいくつかの時間のために知られています。当初は、繊維の 2 つのグループがその収縮特性に基づく特徴付けられると名前は、適切に、遅筋 (タイプ I) と速筋 (タイプ II)。これらのカテゴリは、繊維の代謝に基づくさらに区別されていました。以来タイプ I 繊維はミトコンドリアで豊富であり、酸化的代謝に依存して、彼らを力強く肯定的なニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドテトラゾリウム還元酵素 (NADH-TR) のジアホラーゼ²またはコハク酸脱水素酵素 (SDH) の³で解明しました。染色。対照的に、タイプ II 線維展示低い NADH TR ジアホラーゼの SDH 可変度染色と速筋の 2 つのサブグループに分けられた (タイプ IIA、IIB 型) の相対的な酸化能力に基づいてややぞんざい。繊維のこれらの違いは、ミオシン ATPase 染色によるより効果的に可視化されている型、pH 4.0 で前培養後繊維染色暗いとタイプ IIB 線維はタイプ IIA 線維で pH 10.0 に沈殿物次中古インキュベーションを吸収します。⁴を染色中間。

最近では、ミオシン重鎖 (MyHC) 成分の免疫組織化学的染色繊維タイプ<....

プロトコル

マウスを含むすべてのプロシージャは、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパス機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された (91813(05)1D)

。

1 です一日 1: プライマリ (1 °) ウシ血清アルブミン (BSA) ブロック染色

1. マウスの後肢筋 (例えば、前脛骨筋、ヒラメ筋) の空気乾燥凍結切片の荷電のスライドに取付けた ~ 30 分。 ¹¹. 疎水性障壁 PAP のペンを使用してセクションに境界線を描画します
。
2. 場所 ~ 5 %bsa/リン酸緩衝生理食塩水 (BSA/PBS) 非特異抗体の結合をブロックする各スライド上を 250 μ l 添加します。スライド 1 のため室温で孵化させなさい
3. ブロック中準備 1:50 5% 培養上清 1 ° 抗体の希釈 BSA/PBS (すべてはマウス モノクローナル抗体; 表 1 ^{6 , 12} を参照してください); の 250 μ L を準備スライドごとのソリューションです。氷に 1 ° 抗体株式および希薄を維持

結果

後肢筋 (すなわち、前脛骨筋、ヒラメ筋) 年齢不詳の男性 c57bl/6 マウスから解剖されたフラッシュ 10 月に筋肉を含むプラスチック金型の沈没によって固定されている液体窒素冷却イソペンタン化合物。8-10 μ m の切片が、cryotome を使用して、-20 ° C でカットし、異なる荷電ガラス スライド¹²に転送します。

これらの筋肉が高速と低速筋線維、それぞれ^13,14主にで構成されるので、我々 は前脛骨筋とヒラメ筋を選んだ。次の免疫組織化学的染色個々 のタイプ I、IIA、IIX および IIB MyHCs、明視野と蛍光イメージは捕獲されました。図 1の左のパネル表示型とヒラメ筋の immunost.......

ディスカッション

ここでは、骨格筋線維の種類を識別するための有用な方向を提供しております。そうすることで、データの解析のための新たなアルゴリズムについて述べる.

我々 の結果は主前レポート^5,8,10のものを確認して、私たち自身の手動測定を反映、アルゴリズムが正確に表示されます。まだ、アーティファクトを断面から生じる不透明繊維境界線を含むいくつかのまれな実験的落とし穴が発生しました。注意区分および分析の前に処理されたセクションの警戒の検討を通じてこれらの人工物の影響を最小化できます。特に、シャープなコントラストを達成するために同じ画像を再分類の複数回のラウンドをより少なくより最適な画像分割を回避する可能性があります。

我々 のプロトコルの最も重要なステップは 4.2 に定めるセクションの細胞および細胞外領域で特定の光ファイバー線を描画することによって「クラス .......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ血清アルブミン	Sigma Aldrich	A9418-100G	5% in PBS
疎水性バリア パップペン	科学機器研究所	9804-02
顕微鏡スライド	グローブ サイエンティフィック	1358W
カバーグラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-E
イミュマウント	サーモサイエンティフィック サイエンティフィ	ック 9990402
マニキュア	ロレアル
ニコン エクリプス TE-200 倒立蛍光顕微鏡と明視野顕微鏡		販売終了
SPOT RT/KE	SPOT Imaging Solutions	RT940
Dell Optiplex
BA-F8 一次抗体	開発研究 アイオワ		モノクローナルマウス IgG2b;1:50
SC-71 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monclonal mouse IgG1; 1:50
BF-F3 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monoclonal mouse IgGM; 1:50
6H1 Primary Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa		monoclonal mouse IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 抗 IgG2b	Invitrogen	A21145	ヤギ抗マウス; 1:200
Alexa Fluor 488 抗 IgG1	Invitrogen	A21121	ヤギ抗マウス;1:200
Alexa Fluor 594 抗 IgGM	Invitrogen	A21044	ヤギ抗マウス;1:200
OCT	Sakura Finetek	4583
isopentane	Fisher Scientific	O3551-4	冷却 liguid 窒素
PBS	Fisher Bioreagents	BP665-1	10x, 1x
に希釈 Kim Wipes	Kimberly-Clark	06-666A

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