Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

Resumen

La coloración de Immunohistochemical de las isoformas de cadena pesada de miosina ha surgido como discriminador de estado de la técnica del tipo de fibra del músculo esquelético (es decir, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aquí, presentamos un protocolo de tinción junto con un algoritmo novela semi-automatizado que facilita la rápida evaluación de la morfología del tipo de fibra y fibra.

Resumen

Durante años, distinciones entre tipos de fibras de músculo esquelético se visualizaron mejor manchando de la miosina-ATPasa. Más recientemente, la coloración de immunohistochemical de las isoformas de miosina cadena pesada (MyHC) ha emergido como un discriminador más fino de tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX y fibras de tipo IIB ahora pueden ser identificadas con precisión basada en su perfil de MyHC; sin embargo, manual análisis de estos datos puede ser lento y abajo-derecha tedioso. En este sentido, rápida y precisa evaluación de morfología y composición del tipo de fibra es una herramienta muy accesible. Aquí, presentamos un protocolo para la coloración de immunohistochemical de la estado-de-arte de MyHCs en secciones congeladas de músculo de ratón trasera junto con un algoritmo novela semi-automatizado que acelera el análisis de la morfología del tipo de fibra y fibra. Como era de esperar, el músculo de soleus muestra coloración para tipo I y tipo las fibras IIA, pero no para las fibras tipo IIX o tipo IIB. Por otro lado, el músculo anterior de tibialis fue compuesto predominante de fibras de tipo IIX y tipo IIB, una pequeña fracción de fibras de tipo IIA y poca o ninguna tipo I fibras. Varias transformaciones de imagen fueron utilizadas para generar mapas de probabilidad con el fin de medir diferentes aspectos de la morfología de la fibra (es decir, área de sección transversal (CSA), diámetro de Feret máximo y mínimo). Los valores obtenidos para estos parámetros entonces fueron comparados con los valores obtenidos manualmente. No hubo diferencias significativas se observaron entre ambos modos de análisis con respecto a la CSA, máxima o mínima diámetro de Feret (todos p > 0.05), indicando la precisión de nuestro método. Así, nuestro protocolo de análisis de inmunotinción puede aplicarse a la investigación de los efectos en la composición de músculo en muchos modelos de envejecimiento y miopatía.

Introducción

Se ha sabido por una cierta hora que músculo esquelético se compone de fibras individuales de muchos tipos¹. Inicialmente, dos grupos de fibras se caracterizaron basado en sus propiedades contráctiles y llamado, apropiadamente, contracción lenta (tipo I) y de contracción rápida (tipo II). Estas categorías se distinguen sobre la base de metabolismo de la fibra. Desde el tipo I fibras son ricas en mitocondrias y dependen del metabolismo oxidativo, se aclarado por sólidamente positiva de nicotinamida-adenin-dinucleótido-tetrazolio reductasa (NADH-TR) diaphorase² o Succinato deshidrogenasa (SDH)³ de t....

Protocolo

todos los procedimientos que involucran ratones fueron aprobados por la Universidad de Colorado-Anschutz Medical Campus institucional Animal Care y uso (91813(05)1D).

1. día 1: primaria (1°) Immunostaining con albúmina sérica bovina (BSA) bloqueo

1. al aire secciones congeladas del músculo del miembro posterior de ratón (por ejemplo, tibial anterior, sóleo) montado en diapositivas cargadas de ~ 30 min ¹¹. dibujar un borde alrededor de las secciones usando una barrera hidrofóbica PAP pluma.
2. Lugar ~ 250 μl de 5% BSA/tampón de fosfato salino (PBS/BSA) en cada diapositiva para bloquear la Uni....

Resultados

Miembro posterior los músculos (es decir, tibial anterior, sóleo) disecados de un ratón C57BL/6 Masculino de edad desconocida eran flashes congelado por hundir un molde de plástico que contiene el músculo en OCT en isopentano enfriado en nitrógeno líquido. Luego, usando un cryotome, secciones seriales de 8-10 μm fueron a-20 ° C y transferidas a vidrio cargado positivamente diferentes diapositivas¹².

Discusión

Aquí, hemos proporcionado una dirección útil para la identificación de tipos de fibras de músculo esquelético. De esta manera, se describe un nuevo algoritmo para el análisis de los datos.

Puesto que en gran parte, nuestros resultados los anteriores informes^5,8,10 confirman y reflejan nuestras propias mediciones manuales, el algoritmo parece ser exacta. Aún así, nos encontramos con algunas trampas exp.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9418-100G	5% en PBS
Barrera hidrofóbica Pap Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Portaobjetos de microscopio	Globe Scientific	1358W
Coverglass	Fisher Scientific	12-544-E
Immumount	Thermo Scientific	9990402
Esmalte	de uñas L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Microscopio de fluorescencia invertida y campo claro	Descontinuado
			1:50
SC-71 Banco	de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa		IgG1 de ratón monclonal; 1:50
BF-F3	Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa		ratón monoclonal IgGM; 1:50
6H1 Banco	de Hibridomas de Estudios de Desarrollo de Anticuerpos Primarios en la Universidad de Iowa		IgGM de ratón monoclonal; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b	Invitrogen	A21145	cabra anti-ratón; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1	Invitrogen	A21121	cabra anti-ratón; 1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM	Invitrogen	A21044	cabra anti-ratón; 1:200
OCT	Sakura Finetek	4583
isopentano	Fisher Scientific	O3551-4	frío con nitrógeno líguido
PBS	Fisher Bioreagents	BP665-1	10x, diluido a 1x
Toallitas Kim	Kimberly-Clark	06-666A

SPOT RT/KE Soluciones de imagen SPOT RT940 Dell Optiplex BA-F8 Estudios del desarrollo de anticuerpos primarios Banco de hibridomas en la Universidad de Iowa ratón monoclonal IgG2b;