Dette er en høj fedt diæt fodring protokol for at fremkalde fedme i Drosophila, en model for forståelse grundlæggende molekylære mekanismer involveret i lipotoxicity. Det giver også en høj overførselshastighed triacylglyceride analyse til måling af fedt ophobning i Drosophila og potentielt andre (insekt) modeller under forskellige ernæringsmæssige, miljømæssige, genetiske eller fysiologiske forhold.
Hjertesygdom er den største årsag til menneskers død over hele verden. Talrige undersøgelser har vist stærke forbindelser mellem fedme og hjerte funktionsfejl i mennesker, men flere værktøjer og forskning er nødvendig for at bedre belyse de involverede mekanismer. For over et århundrede, Drosophila genetisk meget tractable modellen har været medvirkende til opdagelsen af vigtige gener og molekylær veje, der viste sig at være særdeles bevaret på tværs af arter. Mange biologiske processer og sygdomsmekanismer er funktionelt bevares i fluen, som udvikling (f.eks., organ planen, hjertet), kræft og neurodegenerative sygdomme. For nylig, undersøgelse af fedme og sekundære patologier såsom hjertesygdomme i modelorganismer, har spillet en meget afgørende rolle i identificeringen af centrale myndigheder involveret i Metaboliske syndrom hos mennesker.
Her, foreslår vi at bruge denne model organisme som et effektivt redskab til at fremkalde fedme, dvs, overdreven fedtophobning, og udvikle en effektiv protokol for at overvåge fedtindhold i form af TAGs ophobning. Ud over den yderst velbevarede, men mindre kompleks genom har flyve også en kort levetid for hurtig eksperimenter, kombineret med omkostningseffektivitet. Dette papir giver en detaljeret protokol for høj fedt diæt (HFD) fodring i Drosophila at fremkalde fedme og en høj overførselshastighed triacylglyceride (TAG) analyse til måling af den dermed forbundne forhøjelse fedtindhold, med formålet at være yderst reproducerbare og effektiv for omfattende genetiske eller kemisk screening. Disse protokoller tilbyder nye muligheder til effektivt undersøge regulerende mekanismer involveret i fedme, samt yde en standardiseret platform for drug discovery forskning til hurtige test lægemiddelkandidater virkning på udviklingen eller forebyggelse af fedme, diabetes og beslægtede metaboliske sygdomme.
Vi befinder os i en tid, hvor fedme og dens tilknyttede økonomiske byrder, er et verdensomspændende problem1. To ud af hver tre amerikanere er overvægtige eller fede med relaterede hjerte patologier, den primære dødsårsag i den voksne befolkning2. Nye effektive metoder er nødvendige for at tilstrækkeligt undersøger de genetiske og molekylære komponenter, der er impliceret i reguleringen af metabolisk syndrom ved hjælp af modelorganismer. Derfor vælger vi frugtflue Drosophila model, fordi det deler de mest basale biologiske processer med pattedyr, herunder mus og mennesker3,4,5,6. Drosophilagenom er meget bevaret under udvikling, men generelt meget mindre med mindre gen dobbeltarbejde og metaboliske kompleksitet, hvilket gør den ideel til at forstå de grundlæggende mekanismer, der er impliceret i mange menneskelige sygdomme4 , 7 , 8. også karakteristiske processer udføres af fedtvæv, tarmen og bugspytkirtlen er repræsenteret i flue og mægle myndighedsopgaver i glukose og lipid metabolisme, for eksempel, der ligner for mennesker9, 10,11. Desuden, den grundlæggende molekylære veje involveret i bekæmpelse af overvægt, insulinresistens og diabetes i mennesker er funktionelt bevaret i Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. som højere organismer, Drosophila har et bankende hjerte, der er dannet under udvikling af lignende processer som pattedyr hjerte3,17. Således er udviklingen af en pålidelig HFD fodring protokol og høj overførselshastighed TAG assay, tilpasset til effektiv screening formål ved hjælp af boksen genetiske værktøj i Drosophila, give et vigtigt middel til at studere og forstå de grundlæggende genetiske grundlag underliggende komplekse metaboliske sygdomme.
HFD fødevarer i sig selv er lavet af en standard laboratorium flyve mad suppleret med kokosolie, som er sammensat primært af mættede fedtsyrer kendt for at være forbundet med metabolisk syndrom18. Mens inducerende fedme i pattedyr modeller, såsom gnavere, kan tage måneder19,20, øger vores optimeret HFD fodring protokol i Drosophila , effektivt og reproducerbar kropsligt fedtindhold i løbet af dage12,14. Denne protokol, tillader i forbindelse med en høj overførselshastighed TAG assay, effektiv masse screening for virkningerne af genetiske faktorer, miljømæssige påvirkninger og lægemiddelkandidater til at opdage nye modulatorer af fedtstofskiftet. Derfor, disse protokoller er sandsynligvis relevant at forstå og/eller bekæmpe overvægt og fedme-associerede menneskelige patologier.
Fodring protokollen er alsidig og kan anvendes til at studere de metaboliske og funktionelle virkninger af enkelt mættet eller umættet fedtsyre. Brugen af denne høje overførselshastighed TAG assay er ikke begrænset til D. melanogaster, men kan tilpasses til en lang række små modelorganismer med neglebånd eller hård ekstracellulære matricer (f.eks., andre Drosophila arter, C. elegans og andre nye hvirvelløse modelorganismer) til at måle fedt indhold under forskellige miljømæssige, genetiske eller fysiologiske forhold, på ethvert stadium af udviklingen, voksenalderen eller fase af metabolisk sygdom. TAG analysen er baseret på en kolorimetrisk måling af en serie af enzymatiske reaktioner, der nedbrydes TAGs til frie fedtsyrer, glycerol, Glycerol-3-fosfat og endelig H2O2 , der reagerer med 4-aminoantipyrine (4-AAP) og 3,5- dichlor-2-hydroxybenzen sulfonat (3,5 DHBS) til at producere en rød farvet produkt, der måles ved hjælp af Spektrofotometer 96-brønd.
Fedme induktion i mus kan tage måneder19,20. I fluer tillader denne HFD fodring protokol for induktion af overskydende fedt ophobning i løbet af dage eller mindre, forårsager en stigning i fedtophobning kun efter 18 h (Se figur 2). HFD fodring med den beskrevne protokol øger glukose indhold 12 og mindsker Bmm lipase og PGC-1 udtryk24. Dette er i modsætning til fastende af …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Erika Taylor til redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 og R01 HL054732) at R.B., en Postdoktoral forskning supplement (R01 HL085481) og fællesskab (AAUW) til S.B.D. og tilskud fra American Heart Association til S.B.D. og R.T.B.
Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |