उच्च वसा आहार खिलाने और उच्च प्रवाह Triacylglyceride परख में Drosophila Melanogaster
Summary
यह एक उच्च वसा आहार खिला प्रोटोकॉल को Drosophilaमें मोटापे के लिए प्रेरित है, बुनियादी आणविक lipotoxicity में फंसा तंत्र को समझने के लिए एक मॉडल । यह भी विभिंन आहार, पर्यावरणीय, आनुवंशिक या शारीरिक स्थितियों के तहत Drosophila और संभावित अंय (कीट) मॉडल में वसा संचय को मापने के लिए एक उच्च प्रवाह triacylglyceride परख प्रदान करता है ।
Abstract
हृदय रोग दुनिया भर में मानव मृत्यु का नंबर एक कारण है । कई अध्ययनों से मनुष्य में मोटापा और हृदय खराबी के बीच मजबूत कनेक्शन दिखाया गया है, लेकिन अधिक उपकरण और अनुसंधान के प्रयासों को बेहतर स्पष्ट शामिल तंत्र की जरूरत है । एक सदी से अधिक के लिए, Drosophila के आनुवंशिक रूप से अत्यधिक असभ्य मॉडल महत्वपूर्ण जीन और आणविक रास्ते की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि अत्यधिक प्रजातियों में संरक्षित किया जा साबित कर दिया । कई जैविक प्रक्रियाओं और रोग तंत्र कार्यात्मक रूप से मक्खी में संरक्षित हैं, जैसे विकास (जैसे, शरीर की योजना, दिल), कैंसर, और neurodegenerative रोग । हाल ही में, मोटापा और माध्यमिक विकृतियों के अध्ययन, जैसे कि मॉडल जीवों में हृदय रोग, मानव में चयापचय सिंड्रोम में शामिल प्रमुख नियामकों की पहचान में एक अत्यंत महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
यहां, हम एक कुशल उपकरण के रूप में इस मॉडल जीव का उपयोग करने के लिए मोटापा प्रेरित है, अर्थात्, अत्यधिक वसा संचय, और एक कुशल को टैग संचय के रूप में वसा सामग्री की निगरानी प्रोटोकॉल विकसित करने का प्रस्ताव । अत्यधिक संरक्षण के अलावा, लेकिन कम जटिल जीनोम, मक्खी भी तेजी से प्रयोग के लिए एक छोटी उंर है, लागत प्रभावशीलता के साथ संयुक्त । इस कागज उच्च वसा आहार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है (HFD) में खिला के लिए मोटापे और एक उच्च प्रवाह triacylglyceride (टैग) वसा सामग्री में संबद्ध वृद्धि को मापने के लिए परख, उद्देश्य के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए कुशल । ये प्रोटोकॉल मोटापे में शामिल नियामक तंत्र की कुशलता से जांच करने के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं, साथ ही विकास पर दवा उम्मीदवारों के प्रभाव के तेजी से परीक्षण के लिए दवा खोज अनुसंधान के लिए एक मानकीकृत मंच प्रदान करते हैं या मोटापा, मधुमेह और संबंधित चयापचय रोगों की रोकथाम.
Introduction
हम एक समय में कर रहे है जहां मोटापा, और उससे जुड़े आर्थिक बोझ, एक विश्वव्यापी समस्या है1। हर तीन अमेरिकियों से बाहर दो अधिक वजन या मोटापे से संबंधित दिल विकृतियों के साथ कर रहे हैं, वयस्क आबादी के भीतर मौत का प्राथमिक कारण2. नई कुशल तरीकों को पर्याप्त रूप से आनुवंशिक और आणविक मॉडल जीवों का उपयोग चयापचय सिंड्रोम के विनियमन में फंसा घटकों की जांच की जरूरत है । इस कारण से, हम फल मक्खी Drosophila मॉडल चुनते हैं क्योंकि यह स्तनधारियों के साथ सबसे बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं को साझा करता है, जिसमें चूहों और मनुष्यों को3,4,5,6शामिल हैं । Drosophilaके जीनोम अत्यधिक विकास के दौरान संरक्षित है, लेकिन कुल मिलाकर बहुत कम जीन दोहराव और चयापचय जटिलता के साथ छोटे, यह मौलिक कई मानव रोगों में फंसा तंत्र को समझने के लिए आदर्श बना4 , 7 , 8. इसके अलावा, विशेषता वसा ऊतक द्वारा किए गए प्रक्रियाओं, आंत और अग्ंयाशय मक्खी में प्रतिनिधित्व कर रहे है और ग्लूकोज और लिपिड चयापचय में विनियामक कार्यों मध्यस्थता, उदाहरण के लिए, कि मनुष्यों के समान हैं9, 10,11. इसके अलावा, मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध और मनुष्यों में मधुमेह के नियंत्रण में शामिल बुनियादी आणविक मार्ग कार्यात्मक रूप से Drosophila melanogasterमें संरक्षण कर रहे हैं12,13,14 , 15 , 16. उच्च जीवों की तरह, Drosophila एक धड़कन दिल है कि स्तनधारी दिल3,17की है कि इसी तरह की प्रक्रियाओं के द्वारा विकास के दौरान गठन किया है । इस प्रकार, एक विश्वसनीय HFD खिला प्रोटोकॉल और उच्च प्रवाह टैग परख के विकास, कुशल स्क्रीनिंग के आनुवंशिक उपकरण बॉक्स का उपयोग कर प्रयोजनों के लिए अनुकूलित Drosophila, एक महत्वपूर्ण का अध्ययन करने के लिए और बुनियादी आनुवंशिक आधार को समझने का मतलब प्रदान अंतर्निहित जटिल चयापचय रोगों ।
HFD भोजन ही एक मानक प्रयोगशाला से बना है नारियल तेल के साथ पूरक खाद्य मक्खी, जो ज्यादातर संतृप्त फैटी एसिड के लिए जाना जाता है चयापचय सिंड्रोम के साथ जुड़े18से बना है । जबकि स्तनधारी मॉडल में मोटापा उत्प्रेरण, ऐसे कुतर के रूप में, महीने में19,20ले सकते हैं, हमारे अनुकूलित HFD Drosophila में खिला प्रोटोकॉल प्रभावी ढंग से और reproducibly के एक मामले में जीव वसा सामग्री बढ़ जाती है दिन12,14। एक उच्च प्रवाह टैग परख के साथ संयोजन के रूप में इस प्रोटोकॉल, आनुवंशिक कारकों के प्रभाव के लिए कुशल जन स्क्रीनिंग की अनुमति देता है, पर्यावरणीय प्रभावों और दवा उंमीदवारों वसा चयापचय के नए मॉडुलन खोजने के लिए । परिणाम में, इन प्रोटोकॉल की संभावना को समझने और/या मुकाबला मोटापा और मोटापे से जुड़े मानव विकृतियों ।
खिला प्रोटोकॉल बहुमुखी है और एक संतृप्त या unसंतृप्त फैटी एसिड के चयापचय और कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस उच्च प्रवाह टैग परख का उपयोग melanogasterतक ही सीमित नहीं है, लेकिन छल्ली या कठिन extracellular मैट्रिक्स के साथ छोटे मॉडल जीवों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे, अंय Drosophila प्रजातियों, सी. एलिगेंस और अंय उभरते invertebrate मॉडल जीवों) विकास, वयस्कता या चयापचय रोग के चरण के किसी भी स्तर पर, विभिंन पर्यावरणीय, आनुवंशिक या शारीरिक स्थितियों के तहत वसा सामग्री को मापने के लिए । टैग परख एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के एक वर्णमिति माप पर आधारित है कि मुक्त फैटी एसिड, ग्लिसरॉल, ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट और अंत में एच2हे2 में टैग नीचा है कि 4 के साथ प्रतिक्रिया-aminoantipyrine (4-AAP) और 3, 5- dichloro-2-hydroxybenzene sulfonate (3, 5 DHBS) एक लाल रंग का उत्पाद है कि एक ९६-अच्छी तरह से spectrophotometer का उपयोग कर मापा जाता है उत्पादन करने के लिए ।
Protocol
1. HFD feeding प्रोटोकॉल
तालिका 1. फ्लाई फूड रेसिपी. यह तालिका हमारे नियंत्रण भोजन तैयार करने के लिए प्रयुक्त विभिन्न अवयवों को सारांशित करती है । एक बा?…
Representative Results
Discussion
चूहों में मोटापा प्रेरण महीने19,20ले सकते हैं । मक्खियों में, इस HFD खिला प्रोटोकॉल दिन या उससे कम के एक मामले में अतिरिक्त वसा संचय की प्रेरण के लिए अनुमति देता है, केवल 18 घंटे के बाद वस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि संपादन के लिए एरिका टेलर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (P01 HL098053, P01 AG033561 और R01 HL054732) R.B. करने के लिए, एक के बाद डॉक्टरेट अनुसंधान अनुपूरक (R01 HL085481) और फैलोशिप (AAUW) S.B.D. के लिए, और अनुदान अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से S.B.D. के लिए और R.T.B.
Materials
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 – 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
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