Détermination des acides sialiques dans les échantillons de foie et de lait de type sauvage et<em> CMAH</em> Souris knock-out.
Summary
Nous décrivons une méthode à base de HPLC pour la détermination de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylenuraminique dans le foie et le lait de souris.
Abstract
Le CMAH (cytidine monophosphate-N-acétylneuraminique acide hydroxylase) est responsable de l'oxydation des acides cytidine monophosphate-N-acétylurauraminiques chez les mammifères. Cependant, les humains ne peuvent pas oxyder l'acide cydaine monophosphate-N-acétylurauraminique en acide cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminique en raison d'une deletion primaire d'exon du gène CMAH . Pour comprendre plus en détail les effets et les implications du manque d'activité du CMAH, un modèle Cmah knock-out chez la souris présente un vif intérêt pour la recherche fondamentale et la recherche appliquée. Le procédé d'analyse pour déterminer le phénotype de ce modèle de souris est décrit ici en détail et est basé sur la détection à la fois de l'acide N-acétylneuraminique et de l'acide N-glycolylenuraminique dans le foie et du lait de souris de type sauvage et Cmah knock-out. Les acides sialiques endogènes sont libérés et dérivés avec de l'O-phénylènediamine pour générer des dérivés fluorogènes, qui peuvent ensuite être analysés par HPLC. Le protocole présenté peut êtreA également demandé l'analyse d'échantillons de lait et de tissus provenant de diverses autres origines et peut être utile pour étudier les effets nutritionnels et sanitaires de l'acide N-glycolylneuraminique.
Introduction
L'acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et l'acide N-glycolylneuraminique (Neu5Gc) sont les acides sialiques les plus courants chez la plupart des mammifères 1 . Bien que capable de synthétiser Neu5Ac de manière endogène, les humains ne sont pas capables de produire Neu5Gc en raison d'une deletion primaire d'exon sur le gène CMAH codant pour une hydroxylase CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Cependant, les produits alimentaires à base d'animaux peuvent être des sources alimentaires de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , conduisant à la production d'anticorps anti-Neu5Gc et déclenchent donc une réponse immunitaire envers Neu5Gc 7 . Cet effet diététique de Neu5Gc est suspecté de contribuer à l'inflammation chronique et à diverses autres maladies 8 , 9 , 10 . Afin de comprendre de façon compréhensive les effets de Neu5Gc en hUn modèle animal pour l'étude systématique des effets des acides sialiques d'origine alimentaire est hautement souhaitable. Bien que les protocoles basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'analyse de souris knock-out soient bien établis et constituent un moyen pratique pour l'évaluation génotypique, l'analyse fonctionnelle du phénotype sur le niveau métabolique nécessite des méthodes d'analyse plus spécifiques. Le phénotype d'un modèle de souris Cmah knock-out peut être évalué en isolant et en analysant la composition des acides sialiques dans des échantillons de foie ou de lait. Plusieurs méthodes pour la détection des acides sialiques dans les tissus animaux ont déjà été rapportées: la réaction des acides sialiques avec le résorcinol 11 ou l'acide thiobarbiturique 12 entraîne la formation d'un produit chromophore et peut être simplement analysée à l'aide d'une configuration basée sur platereader, mais seulement le sialique total La teneur en acide peut être déterminée. En variante, l'analyse des acides sialiques a également été décrite en utilisant une Chromatographie en phase gazeuse13 , la spectrométrie de masse MALDI-ToF 14 ou les méthodes ampérométriques 15 . Cependant, les méthodes d'analyse d'acide sialique les plus couramment appliquées sont basées sur la libération hydrolytique, suivie d'une dérivation de fluorescence et de la Chromatographie liquide 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté ici permet l'évaluation phénotypique des souris homozygotes Cmah knock-out en analysant et en quantifiant les quantités relatives de Neu5Gc de lait et d'échantillons de foie. L'analyse a été effectuée en utilisant une configuration HPLC standard avec détection de fluorescence. L'étape la plus critique de cette procédure est la préparation des colonnes d'échange d'anions et la réalisation de la chromatographie d'échange d'anions; Rég…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 31471703, A0201300537 et 31671854 à JV et LL) et au 100 Plan des talents étrangers (numéro de subvention JSB2014012 à JV).
Materials
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
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