प्रोटीन-आरएनए परिसरों की बढ़ी हुई जांच के लिए क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन
Summary
मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन आरएनए प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक मौलिक उपकरण है। पारंपरिक रूप से अधिकांश प्रयोगों ने ऊर्ध्वाधर जैल का उपयोग किया है। हालांकि, क्षैतिज जैल कई फायदे प्रदान करते हैं, जैसे वैद्युतकणसंचलन के दौरान परिसरों की निगरानी करने का अवसर। हम क्षैतिज देशी जेल वैद्युतकणसंचलन को बनाने और उसका उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
मूल polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन आण्विक जीव विज्ञान का एक मूल उपकरण है जिसका उपयोग आरएनए-प्रोटीन बातचीत के जैवरासायनिक विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। ये बातचीत पारंपरिक रूप से polyacrylamide जैल के साथ विश्लेषण किया गया है जो दो गिलास प्लेटों और नमूनों के बीच उत्पन्न होते हैं जो कि ऊर्ध्वाधर विद्युतीय हैं। हालांकि, ट्रे में डाली polyacrylamide जैल और इलेक्ट्रोफोरेड क्षैतिज रूप से कई फायदे प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट आरएनए सबस्ट्रेट्स और विशिष्ट प्रोटीन के बीच परिसरों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षैतिज जैल वैद्युतकणसंचलन की प्रगति के रूप में कई बार इमेज किए जा सकते हैं। यह प्रयोग के दौरान कई बिंदुओं पर आरएनए-प्रोटीन परिसरों की निगरानी करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है। इसके अलावा, क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन समानांतर में कई नमूनों का विश्लेषण करना संभव बनाता है। यह बहुत ही समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों की सुविधा प्रदान कर सकता है साथ ही विभिन्न घटकों और शर्तों की तुलना करने के लिए कई प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण कर सकता है। यहाँ हम जनसंपर्कआरएनए-प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए क्षैतिज देशी जेल वैद्युतकणसंचिकरण पैदा करने और उनका उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर स्थित है।
Introduction
इलेक्ट्रोफोरेरिक गतिशीलता पाली एशेज (ईएमएसए) ने विशिष्ट प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन 1 , 2 , 3 का विश्लेषण करने के लिए एक अमूल्य जैव रासायनिक उपकरण साबित किया है। इन assays प्रोटीन के बाध्यकारी संबंध के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं आरएनए या डीएनए 3 , न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन परिसरों 1 के घटक stoichiometry 1 और सब्सट्रेट प्रतियोगिता प्रयोगों 1 के माध्यम से शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में महत्वपूर्ण नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।
इन assays के लिए पारंपरिक प्रयोगात्मक सेटअप एक radiolabeled आरएनए सब्सट्रेट के साथ शुद्ध प्रोटीन मिश्रण होते हैं। परिणामस्वरूप परिसरों का विश्लेषण तब किया जाता है जब गैर-निषेधात्मक (देशी) polyacrylamide जैल दो गिलास प्लेटों के बीच डाला जाता है, जिसके बाद नमूना वैद्युतकणसंचलन द्वारा ऊर्ध्वाधर तंत्र 3। हालांकि इस दृष्टिकोण को बायोकैमिकल तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, जो कि न्यूक्लिक एसिड को प्रोटीन की बाध्यता से उत्पन्न होता है, इसमें कई सीमाएं भी होती हैं। उदाहरण के लिए, यह मूल रणनीति अपेक्षाकृत कम थ्रूपुट है और समानांतर में कई बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने की आवश्यकता वाले अनुप्रयोगों के लिए इसे आसानी से अनुकूल नहीं है। इसके अलावा, पारंपरिक ऊर्ध्वाधर तंत्र के साथ, यह वैद्युतकणसंचलन 3 , 4 के दौरान कई बार कॉम्पलेक्स की संभावित निगरानी करने के लिए चुनौतीपूर्ण है।
यहां हम ईएमएसए परख के अनुकूलन को प्रस्तुत करते हैं जो एक फ्लैटबेड उपकरण, क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन और फ्लोरोसेंट लेबल वाले आरएनए सबस्ट्रेट्स 4 , 5 , 6 , 7 में डाली देशी पॉलीकेराइलाइड जैल का उपयोग करते हैं। मूल अवस्था में इन अपेक्षाकृत सरल संशोधनों का समावेशटीजी कुछ शक्तिशाली फायदे प्रदान करता है विशेष रूप से, क्षैतिज flatbed प्रारूप आसानी से एक साथ दर्जनों नमूने का विश्लेषण करने के लिए खुद को उधार देता है 4 एक साथ। इसके अलावा, कुछ आरएनए-प्रोटीन परिसरों के लिए, जैसे कि बिकाउडाल-सी प्रोटीन और उसके आरएनए सब्सट्रेट वैद्युतकणसंचलन के बीच क्षैतिज जेल में अलग-अलग आरएनए-प्रोटीन परिसरों को हल करने की क्षमता बढ़ जाती है और ये अनबाउंड आरएनए सब्सट्रेट से भेदभाव करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मूल polyacrylamide जैल प्रोटीन आरएनए बातचीत की जांच के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं और परंपरागत रूप से इन जैल खड़ी 2 , 3 के electrophoresed हैं। हमने प्रोटोकॉल के एक संशोधन का उपयोग किया है, जो देशी पॉलीएक्ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आंकड़े तैयार करने के लिए लौरा वेंडरप्लेग का धन्यवाद करते हैं। शीट प्रयोगशाला में कार्य एनएसएफ अनुदान 1050395 और एनआईएच अनुदान (R21HD076828) द्वारा समर्थित है। राइडर प्रयोगशाला में कार्य एनआईएच अनुदान R01GM117237 और R01GM117008 द्वारा समर्थित है। मेगन डौडल, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल मेडिकल साइंसेज ऑफ नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (टी 32 जीएम 80034 9) के माध्यम से विस्कॉन्सिन-मैडिसन ग्रेजुएट स्कूल और जैव प्रौद्योगिकी प्रशिक्षण कार्यक्रम के माध्यम से एक विज्ञान आधारित जीआरएस उन्नत अवसर फैलोशिप द्वारा समर्थित है।
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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