Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN
Summary
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.
Abstract
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l'analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l'horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d'ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l'électrophorèse progresse. Cela fournit l'occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l'expérience. De plus, l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.
Introduction
Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l'affinité de liaison des protéines à l'ARN ou à l'ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l'ARN par des expériences de compétition de substrat 1 .
La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d'ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d'une électrophorèse d'échantillon dans un appareil vertical 3. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n'est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l'analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l'appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l'électrophorèse 3 , 4 .
Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d'ARN marqués par fluorescence 4 , 5 , 6 , 7 . L'incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d'échantillons simultanément 4 . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d'ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d'ARN et à les discriminer à partir de substrat d'ARN non lié.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d'opportunités avancées SciMed GRS par l'intermédiaire de l'École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).
Materials
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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