כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההיתוך של המדפים הפלטליים המשניים כדי ליצור את החיך המשני השלם הוא תהליך מפתח בהתפתחות יונקים והפרעותיו יכולות להוביל לחיך משני שסוע, אנומליה מלידה נפוצה אצל בני אדם. מיצוי החיך המשני נחקרה בהרחבה ומובילה למספר מנגנונים סלולריים מוצעים שעשויים לתווך את התהליך. עם זאת, מחקרים אלה בוצעו בעיקר על רקמות עובריים קבוע בשעה timepoints פרוגרסיבי במהלך הפיתוח או בתרבויות explant קבוע ניתח על נקודות זמן סטטיות. ניתוח סטטי מוגבל עבור ניתוח של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים כגון היתוך החיך ואילו סוגים של התנהגויות הסלולר דינמי לתווך היתוך palatal אינו מובן לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך vivo לשעבר משני עוברים עכבר. כדי לבחון התנהגויות הסלולר של היתוך החיך, אפיתל ספציפי קראטין 14-Cre שימש התווית חיך אפיתל תאים ב ROSA26-mTmG עובר לכתב flox. כדי להמחיש אקטין נימי, עכברים LifeACT-mRFPruby כתב שימשו. הדמיה חיה של היתוך החיך המשניים בוצעה על ידי לנתח לאחרונה מדבקות paltal משני דבקו של היום עובריים 14.5 שלב ו culturing ב המכילים agarose התקשורת על צלחת תחתית זכוכית כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ confocal הפוך. באמצעות שיטה זו, גילינו מגוון רחב של התנהגויות הסלולר הרומן במהלך היתוך החיך המשני. הערכה של התנהגויות תאים ברורים מתואמים בחלל ובזמן תורמת רבות להבנתנו את התהליך המורפוגנטי הדינמי הזה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכבר מוטציה קווים, או תרבויות שטופלו מעכבי פרמקולוגי כדי לקדם את ההבנה מראש של איך פיוזון החיך המשני נשלטת.
מבוא
היתוך רקמות הוא צעד חשוב בפיתוח של איברים מרובים. מומים מולדים אנושיים עיקריים כגון שפה שסועה וחך, ספינה ביפידה ומומים של הלב יכולים לנבוע מליקויים בהרכב רקמות 1 . עכבר חך היתוך משני כבר למד בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים הסלולר השליטה היתוך רקמות בפיתוח 2 , 3 , 4 . בעכבר, פיתוח החיך המשני מתחיל סביב E11.5 עם תולדה של מדף palatal משני מכל אחד התהליכים הבילטראליים דו צדדי. הגידול הראשוני של המדפים paltal מתרחשת אנכית לאורך הלשון, עד E14.0 בערך, אז, המדפים paltal להיות מורם אופקית מעל הלשון. תוצאות רפוא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת.
1. הכנת מדיה הדמיה חיה
- הכנת מדיה תרבותית נוזלית
- הוסף 20% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניקסילין U / מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 200 מיקרוגרם / מ"ל חומצה L-ascorbic, 15 מ"מ HEPES כדי Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) / ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הדמיה חיה של החיך explant תרבות חשף תהליכים סלולריים מרובים מתווכים היתוך החיך 6 . הקשר הראשוני בין שני תאים אפיתל מבוצעים על ידי בליטות הממברנה ( איור 2 B-2E ). כאשר שני שכבות אפיתל נפגשים, הם יוצרים מרובת תאים מרובד MES ואחריו intercalation לעשות משולבת תא יחיד שכבת MES באמצעות התכנסות אפיתל ( איור 2 A-2E ואיו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הדמיה חיה של morphogenesis רקמות עם 3D תרבות explant איבר יכול לספק מידע מפורט לגבי תהליכים תאיים כי לא ניתן להציג ניתוח מכתים קונבנציונלי של קטעי רקמה קבועה. שימוש בתרבות explant חוץ גופית של החיך העכברי העכבר העכבר, ראינו כמה התנהגויות הסלולר מעניין מוביל אותנו להציע מנגנון חדש של היתוך החיך המערבת התכנסות epithelial ו שחול התא.
אחד האתגרים הנפוצים במחקרים מסוג זה הוא photobleaching על ידי עירור לייזר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים למ 'דאגלס בנסון לשיחות ראשוניות בנושא הדמיה משנית של החיך. כמו כן, אנו מודים דוד Castandeda-Castellanos (לייקה) וכריס Rieken (Zeiss) על עזרתם כדי להתאים את תנאי הדמיה במיקרוסקופ confocal. אנו מעריכים את Lynsey Hamilton (Bitplane) להצעות מועילות לניתוח תמונות כמותי באמצעות תוכנת Imaris. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NIDCR R01 DE025887.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| DMEM/F12 | טכנולוגיית חיים | 11330-032 | |
| טכנולוגיית סרום בקר עוברי | 16000-044 | ||
| טכנולוגיית L-גלוטמין | לייף | 25030-081 | |
| חומצה L-אסקורבית | סיגמא | A4544-100G | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Life technology | 15140-122 | |
| אגרוז נמס נמוך | BioExpress | E-3111-125 | |
| צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| ג'לי פטרוליאום (וזלין) | Sigma | 16415-1Kg | |
| <חזק>עכברים | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | אלל = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | אלל = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | אלל = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| <חזק>מיקרוסקופ | |||
| אור לבן SP5 | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss Microscopy |
מקורות
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
