Live imaging er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulær adfærd i realtid. Her, beskriver vi en protokol for time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken celler, der giver mulighed for en detaljeret gennemgang af de faser, der er vedtaget under lineage progression fra primære neurale stamceller til differentieret neuroner og glia.
Under hjernebarken udvikling gennemgå stamceller flere runder af symmetriske og asymmetriske celledelinger til at generere nye ophav eller postmitotic neuroner. Senere, skifte nogle stamfaderen til en gliogenic skæbne, tilføje til astrocyte og oligodendrocyte befolkningerne. Bruge time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken cellekulturer, er det muligt at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer at kontrollere tilstanden af celledeling og cellecyklus parametre af stamceller. Ligeledes, skæbnen af postmitotic celler kan undersøges ved hjælp af celle-specifikke fluorescerende reporter proteiner eller post imaging immuncytokemi. Endnu vigtigere, kan alle disse funktioner analyseres på én celle-niveau, identifikation af stamfaderen forpligtet til generation af specifikke celletyper. Manipulation af genekspression kan også udføres ved hjælp af viral-medieret Transfektion, giver mulighed for undersøgelse af celle-selvstændig og ikke-celle-selvstændige fænomener. Endelig giver brugen af fusion fluorescerende proteiner studiet af symmetriske og asymmetriske fordeling af udvalgte proteiner under division og korrelation med datterceller skæbne. Her, beskrive vi metoden time-lapse video-mikroskopi billede primære hjernebarken murine celler for op til flere dage og analysere tilstanden af celledeling, celle cyklus længde og skæbne af nyligt genererede celler. Vi beskriver også en enkel metode til at transfect stamceller, der kan anvendes til at manipulere gener af interesse eller simpelthen mærke celler med reporter proteiner.
Neurale stamceller (NSC) generere neuroner og macroglial celler under hjernebarken udvikling. På tidlige-corticogenesis, NSCs gennemgå flere runder af symmetrisk celledeling, og udvide stamfader pool. Derefter, NSCs kløft asymmetrisk til at generere neuroner direkte eller indirekte gennem mellemprodukter1. Kun ved skifte midt – til slutningen-corticogenesis, stamfaderen for at generere astrocytes og oligodendrocytes2,3,4. Dog stadig de komplette mekanismer, der styrer celle spredning og differentiering samt bidrag af skæbne-begrænset stamfaderen til generation af unikke typer for neuroner eller macroglial celler af intens debat4,5,6. Enkelte kortikale NSCs potentiale til at generere neuroner, astrocytes og oligodendrocytes er blevet grundigt undersøgt in vitro- og vivo ved hjælp af et utal af teknikker såsom: live imaging i single-cellekulturer7,8,9,10,11,12,13; Live billedbehandling i high-density kulturer kulturer3,14,15. Live billedbehandling i Skive kulturer16,17,18; klonede analyse ved hjælp af viral vektor-medieret genetiske mærkning i high-density kulturer14,15,19,20,21; klonede analyse i vivo ved hjælp af retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; og klonede analyse i vivo ved hjælp af transgene dyr34.
Hver af disse teknikker præsenterer fordele og ulemper. For eksempel, er i vivo afstamning sporingen modtagelige til overbegreb og opsplitning fejl3, fører til modstridende konklusioner om potentielle af individuelle kortikale stamfaderen. Desuden både in vitro og i vivo undersøgelser baseret på mærkning af stamceller i tidlig tid-punkter og posterior analyse af celle lineages kan være påvirket af uopdaget forekomsten af celledød i løbet af afstamning-progression35. Derfor skal et passende system til at analysere potentialet i enkelt NSCs giver mulighed for identifikation af alle celler genereret, samt passende karakterisering af celle skæbner i slægt. Kombinationen af primære cellekultur- og levende billedbehandling giver denne indstilling. Ved hjælp af enkelt celle kultur og time-lapse video mikroskopi, har tempel et al. vist parameteren i lineage af individuelle hjernebarken ophav fra neurogenese gliogenesis11. Senere, brugte de det samme system til at vise, at forskellige typer for neuroner er genereret fra en enkelt kortikale stamfader12. Men dette system præsenterer en vigtig advarsel: kun 1% af kortikale stamfaderen isoleret på tidlig corticogenesis generere kloner af 4 eller flere afkom9. Efter tilsætning af FGF2, hyppigheden af celler skabe 4 eller flere celler øger til 8-10%9. Dette tal er dog alt for lille, i betragtning af at stort set alle kortikale ophav er proliferativ på dette stadium. Desuden, de potentielle virkninger af FGF2 på skæbne-specifikation kan ikke udelukkes,36. For at omgå disse begrænsninger, vi brugte high-density cellekulturer, der understøtter spredning af både ventrikulære (Pax6-udtryk) og subventricular (Tbr2-udtrykker) kortikale stamfaderen15. Desuden har real-time observation af disse kulturer vist, at flere funktioner i NSC lineage progression er gengivet under disse betingelser, såsom tilstand af celledeling, forlængelse af cellecyklus, potentiale af enkelt celler til at generere neuroner og glia, blandt andet3,15. For nylig, har vi også brugt dette system til at vise, at CREB-signalering påvirker celle overlevelse af umodne hjernebarken neuroner i mus37. Vi mener således, at time-lapse video-mikroskopi af primære murine hjernebarken celler dyrkes i høj tæthed er en kraftfuld og tilgængeligt værktøj til at studere cellulære og molekylære mekanismer af cellecyklus progression, celledeling, celle overlevelse og celle skæbne specifikation. Sidstnævnte kan opnås ved hjælp af transgene dyr, muliggør identificering af specifikke celle skæbner på realtid38,39,40 eller brugen af post imaging immuncytokemi3,38,41,42.
Her, leverer vi en trinvis protokol for at forberede primære hjernebarken cellekultur støtte udbredelsen af NSCs og den efterfølgende generation af neuroner og macroglial celler. Vi diskuterer også brugen af retrovirale-medieret Transfektion at manipulere genekspression af individuelle celler, som kan identificeres og spores på én celle niveau ved hjælp af time-lapse video mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at studere primære hjernebarken celler isoleret fra begyndelsen til slutningen af corticogenesis i gnavere, men et par justeringer kan kraeves efter fase14. NSCs isoleret fra andre kilder kan også studeres ved hjælp af time-lapse video mikroskopi af 2D kulturer, men den passende dyrkningsbaserede system bør bestemmes ved at sammenligne celle adfærd i in vitro og i vivo38,43.
Realtid observation af primære hjernebarken celler giver mulighed for analyse af celleproliferation, celledeling, celle cyklus længde, Celledifferentiering og celle overlevelse3,14,15,37. Endnu vigtigere, giver det studiet af encellede lineages, føre til identifikation af de mellemliggende faser vedtaget under progression fra NSCs til neuroner3. Endelig, kombinationen…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) og FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa Rio Grande do Norte).
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 12400-024 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437028 | |
Glucose | Gibco | A2494001 | |
B27 | Gibco | 17504044 | |
trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
Isoflurane | Sigma | 792632 | |
anti-MAP2, mouse | Sigma | M4403 | |
anti-GFP chicken | Aves | 0511FP12 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
Goat anti-mouse alexa 594 | Invitrogen | A11005 | |
Goat anti-chicken alexa 488 | Invitrogen | A11039 | |
ImageJ | NIH | ||
tTt | ETH Zurich | ||
Cell observer microscope | Zeiss | ||
Pasteur pipette | |||
PBS | |||
The Tracking Tool (tTt) software | https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html | download link |