纳米海绵在尺寸和交联密度上的可调性

摘要

本文介绍了一种调节共价交联纳米颗粒尺寸和交联密度的方法，这些纳米颗粒由含有侧链官能团的线性聚酯制备而成。通过调控合成参数（聚合物分子量、侧链官能团引入程度以及交联剂当量），可获得适用于药物递送应用的所需纳米颗粒尺寸和交联密度。

摘要

我们描述了一种合成含侧链环氧基团的线性聚酯的方案，并将其制备成具有可控尺寸的纳米海绵。该方法首先合成一种功能化内酯，这是实现所得聚合物侧链功能化的关键步骤。随后通过开环聚合反应共聚戊内酯（VL）和烯丙基戊内酯（AVL）。在聚合完成后，通过后聚合修饰，在部分或全部侧链烯丙基上引入环氧基团。利用环氧-胺化学反应，在稀溶液中将聚合物与小分子二胺交联剂反应，根据目标纳米海绵的尺寸和交联密度形成纳米颗粒。可通过透射电子显微镜（TEM）成像对纳米海绵的尺寸进行表征，以确定其尺寸大小和分布情况。该方法提供了一条可高度调控的聚酯制备路径，从而获得可调控的纳米颗粒，可用于小分子药物的包封。由于聚合物主链的特性，这些颗粒可通过水解和酶降解实现多种疏水性小分子的可控释放。

引言

基于分子间交联的纳米颗粒，其尺寸和交联密度的精确调控对于影响和引导这些纳米体系的药物释放行为具有重要意义¹设计纳米海绵的可调性， 即通过控制前体聚合物的侧链官能团以及引入的亲水交联剂的当量数，可制备具有不同网络密度的颗粒。该方法中，前体与交联剂在溶剂中的浓度对于形成特定尺寸的纳米颗粒而非块状凝胶至关重要。采用定量核磁共振波谱法（NMR）作为表征手段，可精确测定侧链官能团的引入程度及聚合物的分子量。纳米颗粒形成后，可将其浓缩并溶于有机溶剂中，且不呈现纳米凝胶的特性。

近年来，纳米粒子药物递送领域的研究主要集中在使用聚乳酸-co聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）自组装纳米颗粒^2,3,4,5,6PLGA 具有可降解的酯键，使其适用于药物递送应用，并常因其隐形特性而与聚乙二醇（PEG）联用。⁷然而，由于PLGA颗粒的形成具有自组装特性，这些颗粒无法在有机溶剂中溶解，因而难以进行进一步的功能化修饰。相比之下，本研究所提出的方法通过共价....

方案

1. AVL 的合成与表征

1. 在500 mL双口圆底烧瓶（烧瓶1）中放入一个磁力搅拌子，用适当大小的橡胶隔垫和钢丝密封。通过插入隔垫的进气针通入氮气，同时将出气针打开，用丁烷火焰喷枪沿烧瓶外壁缓慢移动加热，对烧瓶进行火焰干燥以除去水分。
   1. 继续用火焰在烧瓶表面均匀加热，直至烧瓶内壁不再出现水汽雾化现象。移开火焰，在持续通入氮气的条件下，使烧瓶冷却至室温。
2. 加入156.25 mL无水四氢呋喃（THF） 通过 将30 mL注射器连接至1号烧瓶。使用干冰/丙酮浴将1号烧瓶冷却至-78 °C。在整个反应过程中用温度计监测温度，并根据需要添加干冰以维持-78 °C。启动磁力搅拌器，使磁力搅拌子在烧瓶内缓慢旋转，形成温和的漩涡。
3. 添加 N,N二异丙基乙基胺（DIPA）（3.30 mL，2.3 × 10⁻² mol）^-2 mol) 通过5 mL注射器加入，随后逐滴加入2.5 M n-丁基锂（9.34 mL，2.3 × 10^-2 mol 通过 一个带有针头锁定装置和金属针头的10 mL玻璃注射器连接至1号烧瓶。使用磁力搅拌器在-78 °C下继续搅拌15分钟。
4. 用火焰干燥（如步骤1.1所述）并用氩气吹扫（操作参见步骤1.1中关于氮气的描述）一个100 mL圆底烧瓶（烧瓶2....

结果

为了评估纳米海绵的合成参数与其最终粒径之间的关系，每种聚合物前体的浓度及其侧链官能团的性质至关重要。图1展示了在二氯甲烷（DCM）中加入聚合物前体和二胺交联剂后，在回流条件下反应12小时成功合成纳米海绵的方案。溶液中环氧基团的浓度对于形成离散颗粒同样关键。纳米海绵合成完成后，采用透射电子显微镜（TEM）成像来确定一组颗粒的精确尺寸。图2分析了一系列不同的纳米海绵实验，依据其聚合物前体的分子量以及侧链官能团的引入情况，以判断这两者之间是否存在影响纳米海绵尺寸的关系。在图2中，当二胺交联剂用量为每分子环氧基团对应一个二胺（即每分子环氧基团含两个胺基）时，无论是6%还是8%的EVL引入量，均观察到随着分子量的增加，颗粒尺寸呈现增大的趋势。

.......

讨论

在药物递送应用中，获得可重复的纳米海绵尺寸至关重要。聚合和纳米海绵合成过程中的多个参数会影响最终颗粒的尺寸和交联密度。我们的分析确定了三个重要参数：聚合物分子量、环氧基侧链官能度以及交联剂当量。为了在纳米海绵合成中获得一系列不同的分子量和环氧基官能度，必须调整VL-co-AVL共聚物的化学计量比。在共聚物环氧化过程中，可通过调节烯丙基官能团的浓度，实现对特定比例烯丙基或全部烯丙基的环氧化。若使用过量的氧化剂，可能导致聚合物链降解；然而，通过减少氧化剂用量可避免该问题。当所有烯丙基均被环氧化后，纳米海绵表面将无剩余的侧链烯丙基用于进一步功能化。此外，在溶液中进行纳米海绵合成时，环氧基的浓度需控制为0.0054 M，这对纳米海绵的合成同样至关重要。

纳米海绵反应此前已进行过评估，以确定获得目标纳米海绵尺寸范围的最佳浓度¹³。该浓度基于聚合物中环氧基团功能的重复单元值进行计算。重复单元是指每个反应性单元所对应的聚合物质量，用于计算每摩尔聚合物中反应性单元的摩尔数。例如，如下所示，若通过定量核磁共振（NMR）测定，分子量为 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,2'-(乙二氧基)双(乙胺)	Sigma-Aldrich	385506-100ML
3-甲基-1-丁醇	Sigma-Aldrich	309435-100ML	无水，≥99%
丙酮	Sigma-Aldrich	179124-4L
烯丙基溴	Sigma-Aldrich	A29585-5G	≥99%
氯化铵	Fisher Scientific	A661-500	去离子水中饱和溶液
细胞培养用水	Sigma-Aldrich	W3500-500ML	经0.45 μm 注射器滤器过滤
二氯甲烷（DCM）	Sigma-Aldrich	270997-100ML	无水，≥99%，含40–150 ppm 戊烯作为稳定剂
乙酸乙酯	Fisher Scientific	E145SK-4
EZFlow 0.2 μm 注射器滤器	Foxx Life Sciences	386-2116-OEM	亲水性PTFE，13 mm
EZFlow 0.45 μm 注射器滤器	Foxx Life Sciences	386-3126-OEM	亲水性PTFE，25 mm
Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃试管（平口）	Fisher Scientific	14-961-31
Fisherbrand 微量离心管	Fisher Scientific	14-666-318	1.5 mL
Hamilton 微量注射器，100 μL	Hamilton Company	80600	型号 710 N SYR，固定针头，22s 规格，2 英寸，2 型针尖
六甲基磷酰胺	Sigma-Aldrich	H11602-100G	≥99%，含 ≤1,000 ppm 环氧丙烷作为稳定剂
己烷	Fisher Scientific	H292-4
无水硫酸镁	Fisher Scientific	M65-500
间氯过氧苯甲酸	Sigma-Aldrich	273031-100G	经缓冲液洗涤纯化至 ≥99%
甲醇（MeOH）	Sigma-Aldrich	322415-100ML	无水，≥99%
正丁基锂溶液	Sigma-Aldrich	230707-100ML	2.5 M 己烷溶液
N,N-二异丙基乙胺	Sigma-Aldrich	550043-500ML	≥99%
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
PELCO Pro 反向（自闭式）镊子	Ted Pella, Inc.	5375-NM
磷钨酸水合物	Alfa Aesar	40116
Q55 超声波破碎仪	Qsonica	Q55-110	55 瓦，20 kHz
SiliaMetS 半胱氨酸	Silicycle	R80530B-10g
SnakeSkin 透析夹	Thermo Scientific	68011
SnakeSkin 透析管，10K 截留分子量	Thermo Scientific	68100
碳酸氢钠	Fisher Scientific	5233-500	去离子水中饱和溶液
TEM 载网	Ted Pella, Inc.	01822-F	超薄碳膜A型，400目，铜网，网格孔径约：42 µm
四氢呋喃（THF）	Sigma-Aldrich	401757-1L	无水，≥99.9%，无抑制剂
三氟甲磺酸亚锡（II）	Sigma-Aldrich	388122-1G
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236
Whatman 滤纸，1号	Fisher Scientific	09-805H	圆形，185 mm
δ-戊内酯	Sigma-Aldrich	389579-100ML	经减压蒸馏纯化