Här presenterar vi ett stegvis protokoll för spridning av nanomaterial i vattenlösning med realtid karakterisering att identifiera den optimala ultraljudsbehandling villkor, intensitet och varaktighet för förbättrad stabilitet och enhetlighet för nanopartiklar dispersioner utan att påverka prov integritet.
Ultraljudsbehandling processen används ofta för de agglomerering och dispergering nanomaterial i vattenlösning baserat nödvändigt att förbättra enhetlighet och stabilitet av suspensionen. I denna studie genomförs en systematisk stegvis för att identifiera optimal ultraljudsbehandling villkor för att uppnå en stabil dispersion. Denna metod har antagits och visat sig vara lämpliga för flera nanomaterial (cerium oxide, zinkoxid och kolnanorör) dispergerade i avjoniserat vatten (DI). Dock med någon förändring i nanomaterial typ eller spridning medium måste det vara optimering av det grundläggande protokollet genom justera olika faktorer såsom ultraljudsbehandling tid, kraft och någon sonikator skriver samt temperaturstegring under processen. Metoden registrerar dispersion processen i detalj. Detta är nödvändigt att identifiera tidpunkter samt andra ovannämnda villkor under ultraljudsbehandling processen där det kan finnas oönskade förändringar, såsom skador på partikeln ytbehandlar därmed påverka ytegenskaper. Vårt mål är att erbjuda ett harmoniserat tillvägagångssätt som kan kontrollera kvaliteten på den slutliga, producerade spridningen. Sådana riktlinjer är avgörande för spridningen kvalitet repeterbarhet i nanovetenskap gemenskapen, särskilt i området nanotoxikologi.
Ultraljudsbehandling är processen att generera kavitation, som innebär skapandet, tillväxt, och kollaps bubblor (ofta kallat hotspots) bildas i vätskan på grund av bestrålning av hög intensitet ultraljud1. I laboratoriemiljö utförs ultraljudsbehandling metoden använder en någon sonikator. Det finns olika sonicators, alla har de generella funktionen hos de agglomerering partiklar, som skingra i ett flytande medium som enskilda (eller primära) partiklar. Genom att tillämpa ultraljudsbehandling, kan provets homogenitet förbättra, eventuellt uppnå en mycket smalare partikelstorleksfördelning. En viktig aspekt att beakta i processen dispersion är stabiliteten i den slutliga spridningen. Här, definieras stabiliteten i suspensionen som där partiklarna inte nöja sig eller sediment ner i deras spridda staten och den genomsnittliga hydrodynamiska diameter mätningar inte varierar med mer än 10% mellan fem upprepade mätningarna under det tid (cirka 10 min)2,3. I området i närheten finns det flera sätt att mäta spridning stabilitet. Detta inkluderar uppskattning av zeta potential (ZP) genom mätning av elektroforetiska mobilitet av partiklar. En annan är att mäta karakteristiska absorptionen av nanopartiklar i UV spektralområde4.
I området nanotoxikologi är är möjligheten att ha kontroll över dispersion kvalitet mycket viktigt, eftersom steget spridning kommer att avgöra viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper, såsom partikelstorleksfördelning/storlek, form, aggregering/gytter, yta avgift, etc. detta i sin tur kommer i slutändan påverkar växelverkan av partiklar med testet massmedia och resultatet av olika in vitro- och in-vivo experiment, för att härleda de potentiella riskerna med nanomaterial.
Ultraljudsbehandling utförs vanligen genom att antingen använda en sonden-typ (direkt) eller ultraljudsbad, eller ultraljudssond med en injektionsflaska diskant (indirekt ultraljudsbehandling). Alla typer av ultraljudsbehandling finns i en rad intensitet och utgång ströminställningar, ibland anpassas med en annan typ av sonotrode för specifika processer eller krav, och är lämpliga för flytande volymer alltifrån 2 till 250 mL. Även om sonden ultraljud är känd för att prestera bättre än bad ultraljudsbehandling på grund av lokaliserade högintensiv5, är bad ultraljudsbehandling ofta att föredra över sonden-typ för beredning av toxikologiska test suspensioner på grund av möjligheten förorening risken genom spetsen, erosion av Titan sond tips efter långvarig användning och sonden nedsänkning djup avvikelser. Likaså är en ultraljudssond försedd med en injektionsflaska diskant fördelaktiga över sonden direkt på grund av ovannämnda Kontaminationsrisker samt drift vänlighet av utrustningen. Flera injektionsflaskor är sonicated samtidigt och med samma intensitet. Detta sparar inte bara tid utan säkerställer att alla prover behandlas lika, vilket gör resultaten bland proverna mer tillförlitliga och jämförbara. I den säkerhetsforskningen av nanomaterial undviks kontaminering alltid. Men den sond någon sonikator passar inte detta krav och har inte testats. Sond sonicators är kända för att orsaka vissa oundvikliga biverkningar såsom prov kontaminering på grund av tip erosion samt minskad energiproduktionen leder till förändringar av spridningsförhållanden, därmed äventyra data reproducerbarhet6, 7 , 8. Dessutom prover oftast körs i avtäckt behållare leder till flytande förluster genom avdunstning samt damm nedfall. För att undvika dessa oavsiktliga förändringar, rekommenderar senaste studier alternativa indirekta sonicators baserat på deras effektiva energi leverans samt fjädring renhet assurance6.
Icke-optimerade ultraljudsbehandling kan ha en skadlig effekt på resultaten. Det eventuellt, kan ändra viktiga fysikaliska och kemiska egenskaperna för nanomaterialen som storlek, storleksfördelning, morfologi och ytladdning2,9. Tidigare litteratur har rapporterat sådana brister att styra ultraljudsbehandling processen och påverkan på partikel parametrar såsom nano-TiO25,10,11, nano-ZnO6och nano-koppar12 . Tidigare studier har dessutom visat att ultraljudsbehandling processen inte bara förändrar Partikelkännetecken utan också styr resultatet av toxikologiska tester12,13.
För att ha kontroll över dispersion processen, är det viktigt att övervaka och förstå hur olika faktorer såsom instrument makt, volymer och varaktighet, någon sonikator typ, etc., kan påverka dispersion kvalitet. Därför finns det ett behov att ha en systematisk procedur för att analysera viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper hos partiklarna i förskingringen vid olika tidpunkter av ultraljudsbehandling processen. Även om sådana överväganden har beaktats av några forskare, är arbete på detta område begränsad. Bihari et al. har studerat spridning stabilitet av olika nanomaterial dispersioner görs med olika ultraljud energier med olika dispersion stabilisatorer14. En senaste översyn av Hartmannn et al. betonade att även om arbetet har gjorts för att förstå de olika faktorer som påverkar nanomaterial spridning kvalitet t.ex., typ av någon sonikator används, ultraljudsbehandling tid, etc., finns det fortfarande ingen väldefinierade och universellt accepterad ultraljudsbehandling förfarande stöder som för närvarande nanotoxikologisk tester och utredningar7,15.
Flera analytiska karakterisering tekniker används för att övervaka dispersion kvalitet. Dessa inkluderar användningen av: dynamisk ljus spridning (DLS), skiva centrifugering, elektrofores ljus spridning (ELS), ultraviolett-synligt ljus (UV-vis) spektroskopi och Transmission Electron Microscopy (TEM), som mäter storlek/partikelstorleksfördelning, Zeta potential, spridning stabilitet och morfologi egenskaper, respektive. DLS används ofta för att bestämma hydrodynamiska diameter (Z-genomsnitt) partiklar och polydispertion index (PdI) av nanomaterial spridning. När det gäller multimodala storleksfördelning av DLS, kanske Z-genomsnittet erhålls inte håller med intensitet-viktade storlek distribution intensiteten. Som sådan, kan medelvärdet av fördelningen av intensitet-viktade storlek citeras. PdI återspeglar bredden av storlek distribution med en skala sträcker sig från 0 – 1, med 0 är ett monodispersed prov och 1 är en mycket polydisperse prova16. Skiva centrifugering är en separation teknik används för att bestämma partikelstorleksfördelning med centrifugal sedimentering i ett flytande medium. Partiklar sediment inom ett optiskt klart och roterande skiva och mängden ljus som sprids av partiklar när de når kanten av skivan är inspelad och omvandlas till partikelstorleksfördelning Stokes lag. Lös multimodala partikel fördelning, är tekniker såsom skiva centrifug mer lämpade eftersom de har en separation mekanism element integrerad i instrumentet. Zeta potential (ζ –potentiella) av partiklar definieras som elektriska potential på deras skeva eller glider planet, som är en fiktiv gräns inom elektriska dubbla lager som skiljer (bulk) vätskan visar normalt trögflytande beteende från den Aktern lager, ett lager som är huvudsakligen består av counter joner och ansåg att flytta med partikeln. Zeta potential är direkt relaterad till ytladdning av partiklar och därför den elektrostatiska växelverkan (dvs, repulsion/attraktion) mellan partiklarna. Denna parameter anses därför en primär indikator för nanomaterial spridning stabilitet. Av konvention zeta potential värde nedan -25 mV och över 25 mV anses stabil17,18. Koncentration och typ av såväl joner som lösning pH, påverka starkt zeta potential19. ELS används för att mäta partiklar i dispersion elektroforetiska rörlighet och denna rörlighet är konverteras till zeta potential genom Henry ekvationen och Smoluchowski eller Hückel modellerna. UV-vis spektroskopi är en teknik som används för att kvantifiera ljuset som absorberas och sprids av ett prov vid en viss våglängd. Det är ofta används för att övervaka spridning stabilitet genom att mäta karakteristiska absorptionen av nanomaterial i regionen UV. Slutligen, TEM används ofta för att visualisera och analysera storlek, storleksfördelning, gytter, och formen av nanopartiklar5,14,15,20.
Vi presenterar en jämförande studie av sex olika nanomaterial dispersioner gjorts med ultraljudsbad och en ultraljudssond försedd med en injektionsflaska tweeter. Partikel koncentration, temperatur, någon sonikator typ och inställningar som används i studien anges i protokollet, så att de experimentella inställningarna för liknande sonder och Ultraljuds bad kan utläsas. De följande nanomaterial används: silver (Ag), cerium oxide (VD2), zinkoxid (ZnO, NM110-hydrofila och NM111-hydrofoba) och kolbaserade nanomaterial såsom kolnanorör (A32 och A106, se Tabell för material).
Bedömning av dispersion kvalitet vid olika tidpunkter längs ultraljudsbehandling processen görs med hjälp av olika karakterisering tekniker, nämligen DLS för storlek/partikelstorleksfördelning, skiva centrifugering för storleksfördelning, ELS för zeta potential, UV-vis-spektroskopi för stabilitet och TEM för partikelform och homogenitet. Ett antal olika nanomaterial alltifrån metalloxider till kolbaserade utvärderas. För jämförelse används kommersiella vattensuspension av Silvernanopartiklar (Ag-NPs) stabiliserad med citrat tak parallellt, för att härleda en relevant kommersiellt tillgängliga suspension förväntade långsiktiga stabilitet. Uppenbarligen denna Ag-NPs modell är inte direkt relaterade till någon av förfaranden som spridning men agerar enbart för att indikera att behöva åter Sonikera eller åter stabilisera upphängningarna efter en tids lagring eftersom förändringar såsom re gytter är bundet inträffa under lagring. Suspensionen förvaras i kylskåpet i två månader. Under denna period kännetecknas spridning för att identifiera potentiella gytter av partiklarna. De första resultaten visar en instabil suspension (som diskuteras i avsnittet resultat ). Därefter utsätts ytterligare denna spridning av olika ultraljudsbehandling behandlingar, liknar den andra nanomaterial som används i studien. Syftet med studien är att bekräfta att vi de kan fällningen klumpar suspensionen genom samma ultraljudsbehandling protokoll. Ag-NPs modellen kan därmed associeras som riktmärke för långtidsstudier som representerar återdispergering av partiklar i optimerade form.
Dispersion protokollen presenteras här likheter dem publicerade i tidigare litteratur och innehåller några av de några tidigare rekommendationer som tidigare arbetstagare7,21,22,23 ,24,25. I denna studie används ett systematiskt och stegvis tillvägagångssätt att övervaka dispersion kvalitet i hela protokollet dispersion. Detta tillvägagångssätt åtar sig realtid karakterisering av nanomaterial dispersioner, för att identifiera optimala experimentella spridningsförhållanden (figur 1).
Figur 1. Flödesschema som skildrar systematik och stegvis sekvens av protokollet dispersion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det yttersta målet för studien är att utveckla en strategi som skulle tillåta identifiering av optimal ultraljudsbehandling villkor att göra dispersioner av ett antal utvalda nanomaterial i vatten. Här görs ett försök att noggrant dokumentera protokollstegen och parametrar under ultraljudsbehandling för att uppfylla de luckor som tidigare identifierats i recensioner samt att följa de rekommendationer som gjorts i de tidigare15. De optimala spridningsförhållanden identifieras genom att karaktärisera dispersioner efter varje ultraljudsbehandling cykel och kontrollera provets stabilitet och enhetlighet. Effekterna av ultraljudsbehandling förfaranden och stabilitet status bedöms utifrån de karakteristiska förändringarna i viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper av nanomaterial, som bestäms av olika analysmetoder: DLS, ELS, UV-vis, och TEM. Det nuvarande protokollet är en anpassad metod för spridning av nanomaterial från den tidigare litteraturen och andra forskning projekt21,22,37,38,39 med några ändringar och förbättringar att ta itu med de viktiga luckorna, steg och deras tillämplighet för bredare nanomaterial av liknande yta profil7. Det krävs dock försiktig justeringar avseende deras ultraljudsbehandling tid, styrka och typ för deras tillämpning på andra nanomaterial. Ytterligare arbete krävs dessutom att upprätta en korrelation mellan ultraljudsbehandling förfarandet och biologisk aktivitet av nanomaterial. Sex olika typer av nanomaterial dispersioner utvärderas och jämfört, främst för deras stabilitet, med hjälp av ett ultraljudsbad och en ultraljudssond försedd med en injektionsflaska tweeter inställda tidpunkter. För att bibehålla suspension renhet och eventuella oavsiktliga ändringar som orsakas på grund av kontaminering, undviks sonden ultraljudsbehandling här. I injektionsflaska diskant, kan injektionsflaskorna förbli stängda. Detta eliminerar eventuella korskontaminering av proverna.
Kalibrering av sonicators är en viktig faktor eftersom det finns en rad sonicators med olika frekvens, amplitud och befogenheter. För att avgöra den effektiv akustisk energi som levereras till fjädringen, utförs kalibrering av sonicators med hjälp av kalorimetri. Akustiska kraften levereras för 70% amplitud inställning för injektionsflaska diskant såväl som för inställningen 100% ultraljudsbad beräknas vara < 1 W (0,75 ± 0,04 W och 0.093 ± 0,04 W, respektive). Men de makt utgångarna anges av tillverkarna för injektionsflaska tweeter och bad någon sonikator är 200 W och 80 W, respektive. Detta indikerar att trots hög strömkällan, mest av energin går förlorad under generering av cavitational bubblor och bara en bråkdel är faktiskt levereras till spridning under behandling26. Nyligen genomförda studier har belyst vikten av cavitational mätning kontroll jämfört med den tillförda effekten för den någon sonikator för en bättre spridning kontroll under ultraljudsbehandling8. Metoden verkar lovande för kontrollerad spridning av mycket känsliga nanomaterial som CNTs och rekommenderas för framtida studier.
Varje teknik som används i studien bygger på olika principer med begränsningar för alla. DLS är inte en idealisk teknik för icke-sfäriska suspensioner samt mycket polydisperse system. Under sådana förhållanden rekommenderas DCS på grund av hög upplösning, noggrannhet och precision40. DCS kan helt separera mycket smala storlek distribution toppar som skiljer så lite som 3%. TEM ger direkta visuella bilder av nanopartiklar och är ett bra verktyg för bestämning av aggregering, spridning, storlek och form av partiklarna, men tekniken kräver prov torkning vilket kan leda till artefakter41. Detta kan elimineras genom att tvätta rutnäten med ultrarent vatten som beskrivs i steg 4.5.3.
Bland annat belyser metoden några kritiska steg såsom typ av flaskor som används i protokollet, Nedsänkningsdjup och position av injektionsflaskorna i ultraljudsbadet samt injektionsflaska diskant. Temperaturkontroll av systemet under agitation är en viktig parameter. Täta vatten förändringar i ultraljudsbad och pulsad läge kör vid injektionsflaska tweeter rekommenderas att undvika någon värme ackumulering under ultraljudsbehandling, därmed undvika ändringar provet. Steget före vätning för hydrofoba prover såsom zinkoxid hjälper i spridningen av partiklar men detta kan medföra vissa oönskade förändringar. Ultraljudsbehandling tid och energi bör vara hög nog att fällningen de klumpar partiklarna men inte för mycket att den bryter partiklarna. Resultaten indikerar att agglomerate brott är beroende av partikel typ.
Våra resultat betona vikten av att ha en detaljerad dispersion protokollet, eftersom resultaten visar att viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper potentiellt kan ändras under ultraljudsbehandling processen, som styrs av faktorer såsom någon sonikator typ, ultraljudsbehandling varaktighet tid, och makt utgång. Resultat har visat att provet integritet äventyras potentiellt på högre intensitet agitation. Resultaten visar att CNTs är mycket känslig för agitation, så skador är mycket sannolikt att uppstå när ultraljudsbehandling varaktighet och styrka byts. Nära till optimala inställningar för spridningen av CNTs är mellan 2-15 min i ultraljudsbadet och endast 2 min med en ultraljudssond. Dock kan ultraljud fortfarande ha orsakat vissa nanotube förkortningar, som inte kan kvantifieras korrekt här. DLS kan inte vara en idealisk teknik för karakterisering av CNTs men det fortfarande kan ge hydrodynamiska diameter för nanorör och informationen kunde vara informativ om skillnader i längd distributioner av CNTs bland olika prover16, 42,43. Tidigare studier visar att protokollet dispersion av CNTs kan förbättras avsevärt genom tillsats av tensider som de ytaktiva molekylerna absorberas på den nanotube enskiktslager, vilket ger ett hinder för brott på grund av ultraljudsbehandling35, 44. men detta kan inte jämföras direkt till protokolls eftersom inga tensider är involverade i detta fall. Det är viktigt att notera att säkerställa fördelningen av längd storlek när det gäller CNTs är mycket viktigt, eftersom proportionerna är ofta korrelerad med vissa toxikologiska svar. Däremot VD2 gav olika resultat jämfört med CNTs, i vilka långvarig ultraljudsbehandling tider med hjälp av ultraljudsbad eller sond, leda till bildandet av primära partiklar. Skillnaden i resultat mellan CNT och CeO2 fall belyser vikten att skräddarsy dispersion protokoll t.ex., optimera ultraljudsbehandling tid och effekt, i enlighet med utgångsmaterial dvs, typ av nanomaterial pulver. Varje nanomaterial pulver Provtyp är annorlunda, eftersom det kommer att finnas olika grad av gytter inom pulvret själv. I vissa fall har de gytter processen framgångsrikt resulterade i de gytter upp till primära partiklar nivå, som framgår av framväxten av andra formade partiklar i TEM bilder, som inte var synliga innan de ultraljudsbehandling steget. Långvarig ultraljudsbehandling resulterade i att kontinuerligt bryta cerium oxide agglomeratbildning i olika vinklar vilket leder till mångfacetterad partiklar.
När det gäller kommersiellt-köpt vattenhaltiga provet av Ag-NPs dispersioner betonar våra resultat också behovet av långsiktiga stabilitet och enhetlighet bedömning. Det finns ett behov av att säkerställa att dispersioner har karaktäriserats tillräckligt före användning, särskilt i fall av långtidslagring. Nanomaterial har dock en mycket kort hållbarhetstid. De åldras med tiden och kan bete sig annorlunda efter långtidslagring jämfört med en nylagad dispersion.
Resultatet här belysa behovet av en harmoniserad strategi för att identifiera en optimerad protokollet för olika nanomaterial. Presenterade föreslagna strategin är att genomföra olika variationer i metoden ultraljudsbehandling och se till att dispersioner vid olika tidpunkter kännetecknas tillräckligt med kompletterande analytiska metoder. Vikten på användningen av en multi metod metoden att karakterisera och övervaka dispersion kvalitet genom tid och olika experimentella förhållanden har belysts av tidigare arbetstagare45. Även om olika metoder för ultraljudsbehandling har presenterats för att tillgodose specifika nanomaterial spridning i studien, kan potentiellt de användas som grund för att skingra andra metall och metall-oxid nanomaterial (av liknande ytegenskaper) i vatten. Men kräver att ha någon förändring i antingen nanomaterial typ eller flytande medium behovet av att optimera det grundläggande protokollet, som kan göras genom noggrann justering av olika faktorer t.ex., ultraljudsbehandling tid, styrka och någon sonikator typ. Oavsett protokoll väljs och identifieras som optimalt, det är alltid ett behov att ha en detaljerad rapport om system och stegvis sekvens av ultraljudsbehandling dispersion förfarandet. Detta är viktigt att förbättra tolkningsbarhet och jämförbarhet. En av program i detta protokoll är att underlätta data jämförbarhet bland andra labb som leder till ett harmoniserade och standardiserade tillvägagångssätt för framtida studier. De aktuella parametrarna för metodik och kontroll kan utnyttjas för andra spridning medier förutom vatten och jämförelser kan ritas på ett enskilt fall.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från NE/J010783/1. Projektet NanoValid har fått finansiering från EU: s sjunde Program för forskning, teknisk utveckling och demonstration under lån avtal nr 263147.
Cerium oxide nanopowder | Sigma-Aldrich | 544841 | <25 nm particle size (BET) |
Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM110 | hydrophylic |
Zinc oxide | European Commission's Joint Research Centre (JRC) | NM111 | hydrophobic |
Multi walled carbon nanotubes | NanoMile project (Large Collaborative Project under the European Commission's 7th Framework Programme) | A32 (MWCNT1) | 3.0±1.8 µm long, O/C ratio of 4.5% |
Multi walledcarbon nanotubes | NanoMile project | A106 (MWCNT2) | 3.3±2.4 µm long, O/C ratio of 7% |
Silver dispersion | Sigma-Aldrich | 730785 | 10 nm particle size (TEM), 0.02 mg/mL |
Zetasizer nano | Malvern Instruments | Particle size and zeta-potential measurements | |
Disc Centrifuge | CPS instruments Inc. | Model DC 24000 | Particle size distribution by centrifugal sedimentation |
Transmission electron microscope | JEOL USA | Jeol 1200EX TEM | Bright field images, particle size, shape, agglomeration |
Ultrasonic probe fitted with a vial tweeter | Hielscher | UIS250V | Sonicator |
Ultrasonic bath | Branson | Model 1510 | Sonicator |
Eppendorf vials | Eppendorf | 2236411-1 | 1.5ml capacity |
UV-vis spectrophotometer | Jenson flight deck | Model 6800 | SPR peaks, suspension stability |
Disposable folded capillary cell | Malvern Instruments | DTS 1070 | for the measurement of elecr |
Zeta- potential standard | Malvern Instruments | DTS 1235 | |
Quartz cuvette | Jasco | 1103-0042 | Rectangular quartz cell 10 x 100 Spectrosil Quartz with lid 190 -2700 nm |