Aorta Ring co kultur analysen: Et praktisk verktøy for å vurdere Angiogenic potensialet av Mesenchymal Stromal celler In Vitro
Summary
Her presenterer vi en ny anvendelse av aorta ring analysen der prelabelled mesenchymal celler er co kulturperler med rotte aorta-avledet endothelial nettverk. Denne romanen metoden tillater visualisering av Mesenchymal Stromal celler (MSCs) homing og integrasjon med endotelial nettverk, kvantifisering av Nettverksegenskaper og evaluering av MSC immunophenotypes og gene uttrykk.
Abstract
Angiogenese er en kompleks, sterkt regulerte prosess som er ansvarlig for å gi og opprettholde tilstrekkelig vevsperfusjon. Utilstrekkelig blodkar vedlikehold og patologisk misdannelser kan resultere i alvorlig iskemiske sykdommer, mens altfor rikelig vaskulær utvikling er assosiert med kreft og inflammatoriske lidelser. En lovende form for pro-angiogenic terapi er bruken av angiogenic celle kilder, som kan gi regulatoriske forhold, samt fysiske støtte for nylig utvikle blodkar.
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er grundig undersøkt kandidater for vaskulær gjenfødelse deres paracrine effekter og deres evne til å oppdage og hjem iskemiske eller betent vev. Spesielt første trimester menneskelige navlestreng perivascular celler (FTM HUCPVCs) er en meget lovende kandidat på grunn av deres pericyte-lignende egenskaper, høy proliferativ og multilineage potensialet, immun rettigheter egenskaper og robust paracrine profil. For å effektivt vurdere potensielt angiogenic regenerativ celler, er det en forutsetning å teste dem i pålitelig og “oversettbare” pre-klinisk analyser. Aorta ring analysen er en ex vivo angiogenese modell som tillater enkel kvantifisering av rørformede endothelial strukturer, gir tilbehør støttende celler og ekstracellulær matrix (EFM) fra verten, utelukker inflammatorisk komponenter og er rask og billig å definere. Dette er en fordel i forhold til i vivo modeller (f.eks, hornhinnen analysen, Matrigel plug analysen); aorta ring analysen kan spore administrert cellene og observere intercellulære interaksjoner og unngå xeno-uimottakelig avvisning.
Vi presenterer en protokoll for en ny anvendelse av aorta ring analysen, som inkluderer menneskelige MSCs i co kulturer med utvikle rotte aorta endothelial nettverk. Denne analysen kan for analyse av MSC bidrag til rør formasjon og utvikling gjennom fysisk pericyte som interaksjoner og deres styrke aktivt migrering til områder av angiogenese og vurdere deres evne til å utføre og megle ECM behandling. Denne protokollen gir ytterligere informasjon om endringer i MSC fenotypen og gene uttrykk etter co kultur.
Introduction
Den komplekse prosessen med angiogenese forbedrer og opprettholder vevsperfusjon ved å fremme nytt blod fartøy utvikling fra eksisterende blodkar1. Det er en strengt regulert, balansert prosess av pro-angiogenic og anti-angiogenic faktorer. Noen mangel på dette systemet kan føre til utilstrekkelig fartøyet vedlikehold eller vekst, forårsaker alvorlig iskemiske sykdommer som hjerteinfarkt sykdom, slag og nevrodegenerative lidelser. Men er overdrevet vaskulær utvikling karakteristisk for forhold som kreft og inflammatoriske lidelser2.
Utvikle terapier som mål å kontrollere angiogenese for å oppnå gode vev gjenfødelse er viktig. Til tross for omfattende prekliniske og kliniske undersøkelser kunne forsøk på å stimulere angiogenese pro-angiogenic faktorer og microRNAs oppnå ønskede resultatene3,4,5. Mulige årsaker for forbigående effekter inkluderer: begrenset levetid angiogenic proteiner og nukleinsyrer og begrenset antall målrettet vekstfaktorer6,7. Selv om løselig angiogenic faktorer er avgjørende for å starte angiogenese, avhenger vedlikehold og funksjonalitet i blodkar støtte celletyper inkludert pericytes og glatt muskel celler8. Feltet av pro-angiogenic terapier er nå Utforsker mulige stilk cellen og stamfar celle kilder som kan gi angiogenic faktorer lokalt, mens fysisk støtter nylig utviklet blodkar, selvtillit fornyelse eller selv skille i endothelial-lignende celler9,10. Finne den optimale angiogenic celletyper med evne til å oppfylle disse funksjonelle krav har en store løftet for iskemiske vev gjenfødelse.
For å kunne oversette potensielle cellen-basert behandling til kliniske studier, må pre kliniske studier demonstrere deres effekt og markere underliggende angiogenic mekanismer. Til tross for det høye antallet etablerte angiogenese analyser, feltet mangler en “gull-standard” i vitro analysen som pålitelig kunne evaluere effekten av potensielle kandidat cellen typer11,12, 13. de fleste i vitro angiogenese analyser (inkludert endothelial spredning, migrasjon og rør formasjon analyser) vanligvis vurdere effekten av celler eller forbindelser på endotelceller phenotypical endringer eller differensiering inn rørformet og nettverk strukturer14,15. Mens disse funksjonene er kritiske for angiogenese, en “oversettbare” analysen bør også vurdere: 1) i augmentation eller utskifting av de støtte celletyper inkludert pericytes eller glatt muskelceller, 2) behandling av ECM og/eller kjelleren membran, og 3). effektiviteten til fremme dannelsen av funksjonelle microvasculature. I vivo angiogenese modeller, inkludert hornhinnen analysen og Matrigel plug analysen, recapitulate unike i vivo -microenvironment men er utfordret av problemer med sporing administrert celler å observere fysisk interaksjon. Videre kan i vivo modeller, xeno-uimottakelig avvisning oppstå mens testing potensielle allogene cellen terapi kandidater16. Ex vivo angiogenese modeller, spesielt aorta ring analysen kan gi: 1) lett observasjon og måling av rørformede strukturer, 2) tilbehør støttende celler, 3) ECM fra verten og kunstig forsyninger, 4) Utelatelse av inflammatoriske komponenter og 5) rask og billig17,18. Vanligvis kan aorta ring analysen teste angiogenic potensialet i små sekretoriske proteiner, farmakologiske agenter og transgene gnager modeller19,20,21.
MSCs er lovende kandidater for vaskulær gjenfødelse primært gjennom deres paracrine-mediert effekter22,23,24. MSCs har vist seg å skille ut viktige angiogenic faktorer inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), Hepatocyte vekstfaktor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) og angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kan også detektere hjem iskemiske eller betent vev, men nøyaktig mekanismene er fremdeles under etterforskning. Økende grad støtter litteraturen hypotesen at de fleste MSCs oppstå fra perivascular cellene, co express pericyte indikatorer og kan oppføre seg som pericytes27. HUCPVCs er en ung MSCs avledet fra perivascular regionen navlestrengen menneskelig. De representerer en befolkning på MSCs med pericyte-lignende egenskaper og har vært preget fra både FTM og begrepet kontrollkabler. FTM HUCPVCs viser en høy uttrykk for pericyte inkludert CD146 og NG2, høy proliferativ og multilineage potensial, immun rettigheter egenskaper og vise en robust paracrine profil28. FTM HUCPVCs er en ideell kandidat celle type å fremme regenerering av skadde vevet gjennom bruk av nye blodkar via pericyte-lignende egenskaper.
For å teste angiogenic potensialet og pericyte-lignende egenskaper av menneskelig MSCs, er et svært begrenset antall angiogenese analyser tilgjengelig der positive angiotropic overføring (heretter referert til som “homing”), ECM behandling og utvikling av fysisk interaksjoner mellom celletyper kan undersøkes, mens skaffe kvantitative data på microvasculature utvikling.
Dette vil vi presentere en protokoll som beskriver en ny anvendelse av aorta ring analysen. Menneskelige MSCs var co kulturperler med utvikle rotte-avledet aorta endothelial nettverk for å vurdere deres bidrag til rør formasjon, modning og homeostase. Denne versjonen av aorta ring analysen vurderer evne og styrken på cellen terapi kandidater til hjem til nettsteder av angiogenese, utføre megle ECM behandling og bidra til endotelial rørformede utvikling gjennom etablering av pericyte-lignende fysiske interaksjoner. Kvantifisere virkningen MSCs på i vitro endothelial nettverk dannelse og observere intercellulære interaksjoner, optimalisert vi også en protokoll for å isolere MSCs fra co kulturer. Ved å utføre flowcytometri og qPCR, er det mulig å karakterisere endringer i MSC fenotypen og gene uttrykk etter co kultur. Som modell celletyper, vi sammenlignet ontogenetically tidlig (prenatal) og slutten (voksen) kilder for menneskelige MSCs: FTM HUCPVCs og menneskelige Ben margtransplantasjon-avledet MSCs (BMSC), henholdsvis i aorta ring analysen. Vi foreslår at aorta ring analysen kan brukes å studere angiogenic potensialet i en fysisk støtte celle type når under etterforskning for angiogenic regenerativ programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere kritiske stadier i å sette opp en vellykket aorta ring analysen MSC co kultur eksperiment. Først, de viktigste trinnene når isolere og snitting aorta er: 1) å skaffe utelukkende thorax segmentet av aorta; 2) nøye fjerne forgrening blodkar, forbinde og fettvev og; 3) kutte selv deler av aorta (~ 1 mm) å begrense variasjon mellom hver analysen. Andre er vellykket innebygging av aorta ringer i BME avgjørende for denne analysen. Hvis BME er ikke helt polymerized eller polymerized ujevnt, aorta ringene inn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker følgende stab medlemmer og forskning personell: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai og Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
