Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten
Summary
Kombination aus Ivacaftor und Ivacaftor-Lumacaftor sind zwei neue CF-Medikamente. Allerdings gibt es noch ein Mangel an Verständnis über ihre PK/PD und Pharmakologie. Wir präsentieren Ihnen eine optimierte HPLC-MS-Technik für die simultane Analyse von Ivacaftor und seine Hauptmetaboliten und Lumacaftor.
Abstract
Mängel in der Mukoviszidose-Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) sind die Ursache für Cystische Fibrose (CF), eine Krankheit mit lebensbedrohlichen pulmonale Manifestationen. Ivacaftor (IVA) und Ivacaftor-Lumacaftor (LUMA) Kombination sind zwei neue Durchbruch CF-Medikamente, die direkt die Aktivität und des Handels des defekten CFTR-Proteins modulieren. Allerdings gibt es noch einen Mangel an Verständnis auf Pharmakokinetische/pharmakodynamische Parameter und der Pharmakologie des Ivacaftor und Lumacaftor. Die HPLC-MS-Technik für die gleichzeitige Analyse der Konzentrationen von Ivacaftor, Hydroxymethyl-Ivacaftor, Ivacaftor-Carboxylat und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten bei Patienten, die Standardkombination Ivacaftor oder Ivacaftor-lumacaftor Therapie wurde bisher von unserer Gruppe entwickelt und teilweise validiert, um FDA-Standards. Jedoch um die Hochdurchsatz-Analyse einer größeren Anzahl von Proben zu ermöglichen, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte (2,6 µm, C8 100 Å; 50 x 2,1 mm) und ein gradient Lösungsmittelsystem ( 0-1 min.: 40 % B; 1-2 min: 40-70 % B; 2-2,7 min: hielt bei 70 % B; 2,7-2,8 min: 70-90 % B; 2,8-4,0 min: 90 % B waschen; 4.0-4,1 min: 90-40 % B; 4,1-6,0 min: hielt bei 40 % B) anstelle einer isokratischen Elution. Ziel dieser Studie war es, HPLC-MS Analyse pro Probe dramatisch von ~ 15 min, nur 6 Minuten pro Probe, verkürzen die für die Analyse einer großen Menge von Patientenproben unerlässlich ist. Diese sinnvolle Methode werden erhebliche Dienstprogramm für Studien in der Exposition-Wirkungs-Beziehungen dieser Durchbruch CF Medikamente.
Introduction
Cystische Fibrose (CF) ist eine gemeinsame genetische Krankheit unter Einbeziehung der exokrinen Schleim Drüsen von Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse und Darm verursacht progressive Multi-Organversagen, wie einen Rückgang der Lungenfunktion und Pankreasinsuffizienz1, 2,3. Ivacaftor (IVA) ist der erste Food and Drug Administration (FDA, USA) und European Medicines Agency (EMA) genehmigt Mukoviszidose Trans-Membran Leitwert Regulator (CFTR) Potentiator Droge, mit nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit produziert eine erhebliche Verbesserung der Lungenfunktion gegenüber Placebo in eine kleine Teilmenge der CF-Patienten mit G551D-CFTR [Glycin (G) in Stellung 551 wird ersetzt durch Asparaginsäure (D)] Missense-Mutation (~ 4-5 % der Bevölkerung CF)4,5. Oral verabreicht das Medikament erhöht die CFTR-Kanal öffnen, wodurch die Chlorid-Ionen-Fluss und Beeinflussung der primären Defekts, der die die klinischen Manifestationen von CF4,6führt. IVA-Monotherapie ist leider nicht wirksam bei Patienten mit häufiger homozygoten F508del-Mutation [in Frame Löschen des CFTR-Gens führt zu Verlust von Phenylalanin (F) an Position 508] wodurch fehlgefaltete CFTR, die in ~ 50 % der zu sehen ist die CF Bevölkerung7,8.
Vor kurzem hat die FDA Zulassung für die Kombination von IVA mit der CFTR-Korrektor Medikament Lumacaftor gewährt. Die clevere Strategie verbinden CFTR-Korrektor (Lumacaftor, LUMA), der F508del-CFTR an der Zelloberfläche mit einem Modulator (IVA) birgt die CFTR-Kanal Aktivität, potenziert, erweitert effektiv das Behandlungsfenster zu einem Großteil der CF Bevölkerung5 . Es bleiben Fragen über ob diese Medikamente ihre Versprechen zu erfüllen wie eine Reihe von widersprüchlichen berichten, dass Zweifel auf ihre klinische Wirksamkeit9,10entstanden sind. Außerdem wurden Verbesserungen der Lungenfunktion nur bescheiden (2,6-4 % für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination) im Vergleich zu dem Erfolg mit IVA-Monotherapie bei Patienten mit einem G551D Mutation (10,6-12,5 %)8. Potenzielle antagonistische Wechselwirkungen zwischen IVA und LUMA, die potenziell die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination einschränken stammen aus seiner weniger als ideal pharmakokinetischen Eigenschaften7,11. IVA ist umfassend durch Cytochrom P450 Enzyme (CYP), in erster Linie auf einen aktiven Metaboliten Hydroxymethyl-IVA (IVA-M1, M1) und eine inaktive Form IVA-Carboxylat (IVA-M6, M6)7,12metabolisiert. CYP3A4-Induktor LUMA, auf der anderen Seite ist nicht extensiv metabolisiert und ist weitgehend unverändert in den Kot11ausgeschieden. Wie CYP3A4 Induktoren Cytochrom Stoffwechsel induzieren, konnte Ivacaftor (CYP3A4-Substrat) Konzentrationen reduziert werden. Darüber hinaus IVA und LUMA sind sehr hydrophobe Moleküle und sind ~ 99 % gebunden an Plasmaproteine, welche Grenzen deutlich frei (Wirkstoff) Konzentration1,13.
Gemeinsam können diese Faktoren zusammen kommen, die klinische Wirksamkeit der Ivacaftor-Lumacaftor Kombination zu begrenzen. Es ist nicht bekannt, ob optimale Plasmakonzentrationen unter dem aktuellen Dosierungsplan für Ivacaftor-Lumacaftor Kombination erreicht werden oder wenn die therapeutische Schwelle8beibehalten wird. Derzeit gibt es einen Mangel an Informationen hinsichtlich der pharmakokinetischen Parameter wie die Peak und Steady-State Plasmakonzentrationen von Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor. Angesichts den notierten Metabolismus von Ivacaftor und Lumacaftor, ist Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen Voraussetzung für optimale Dosierung Therapien für Ivacaftor oder Ivacaftor-Lumacaftor Therapie zu erreichen. Unsere Gruppe hat kürzlich die erste HPLC/LC-MS-Methode zur Überwachung der Exposition-Wirkungs-Beziehungen von IVA und LUMA14veröffentlicht. Bisher wurden keine alternativen Verfahren zur Messung der Konzentrationen von Ivacaftor, seiner Metaboliten und Lumacaftor beschrieben. Hochdurchsatz-Analyse eines größeren Patienten Kollektivs ermöglichen und Analysezeit drastisch verringern, unsere Gruppe wurde optimiert, die gemeldeten Methode durch den Einsatz einer kleineren Poren Größe Reverse-Phase-Chromatographie Spalte und ein gradient Lösungsmittelsystem, reduziert Kosten und Laufzeiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie bereits berichtet hat unsere Gruppe für das erste Mal entwickelt und validiert eine HPLC und LC-MS Methode zur schnellen Erkennung und Quantifizierung von Ivacaftor und seiner wichtigsten Metaboliten Hydroxymethyl-IVA M1 (aktiv) und IVA-Carboxylat M6 (inaktiv); und Lumacaftor im Plasma und Auswurf von CF Patienten14. Der Test unserer Gruppe zuvor berichtet wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentration von LUMA, IVA, IVA-M1 und IVA-M6 im Plasma und Auswurf von CF-Patienten, die eine stati…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.l. und t.v. werden durch das National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) von den National Institutes of Health (R01 AI111965) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Allergy und Infektionskrankheiten oder die National Institutes of Health. MC ist eine australische NHMRC Principal Research Fellow. J. L. ist eine australische National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Research Fellow und t.v. ist eine australische NHMRC Industrie Career Development Level 2 Research Fellow. E.K.S ist eine ausgestattete junge Botschafter 2017 für ASM (American Society for Microbiology) und wird von den australischen Postgraduate Award unterstützt.
Teile dieser Arbeit wurde auf 12th Australiasian Konferenz über Mukoviszidose In Melbourne (5-8th August 2017) präsentiert.
Materials
| IVA (Cat#S114) | SelleckChem (USA). | ||
| LUMA (Cat#S1565) | SelleckChem (USA). | ||
| IVA-carboxylate (Cat# 510242247CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| hydroxymethyl-IVA (Cat# 510240849CS) | Clearsynth (Canada). | ||
| Methanol (MeOH, LC-MS grade), | Sigma-Aldrich | ||
| acetonitrile (ACN, LC-MS grade) | Sigma-Aldrich | ||
| formic acid (FA) | Sigma-Aldrich | ||
| triple-quadrupole Shimadzu 8030 LC-MS | |||
| Phenomenex Kinetex (2.6 µm C8 100 Å; 50 × 2.1mm) | |||
| (KrudKatcher Ultrea HPLC In-Line Filter 0.5 m Depth Filter x 0.004inID). | |||
| 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tube (VWR). | |||
| Eppendorf Centrifuge 5430 | |||
| 13-mm syringe filter (0.45 µm nylon, GRACE, USA) | |||
| [Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 µL, PTFE/Silicone septa]. |
References
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