Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellen zijn bedekt met een mantel koolhydratenketens (glycanen) die gewoonlijk veranderd zijn in kanker en die variaties in siaalzuur (Sia) expressie omvatten. Dit zijn zure suikers die een 9-carbon ruggengraat hebben en die vertebraten glycanen op de celoppervlakken dichten. Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn N- acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en zijn gehydroxyleerde vorm, N- glycolylneuraminezuur (Neu5Gc). Mensen kunnen geen endogene Neu5Gc produceren door de inactivatie van het gen dat codeert voor cytidine 5'monofosfaat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Buitenlandse Neu5Gc wordt verkregen door menselijke cellen door het dieetverbruik van rood vlees en zuivel en verschijnt vervolgens op diverse glycanen op het celoppervlak, die hoofdzakelijk op carcinomen accumuleren. Derhalve hebben mensen circulerende anti-Neu5Gc antilichamen die verschillende rollen spelen in kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde aandoeningen en die potentieel diagnostisch en therapeutisch worden.rgets. Hier beschrijven we een high-throughput sialoglycan microarray test om dergelijke anti-Neu5Gc antilichamen in de menselijke sera te beoordelen. Neu5Gc-bevattende glycanen en hun bijpassende paren controles (Neu5Ac-bevattende glycanen), elk met een kern primaire amine, zijn covalent gekoppeld aan epoxy-beklede glazen glijbanen. We illustreren het afdrukken van 56 glijbanen in een 16-bronsformaat met behulp van een specifieke nano-printer die maximaal 896 array's per print kan genereren. Elke dia kan worden gebruikt om 16 verschillende humane sera monsters te screenen voor de evaluatie van anti-Neu5Gc antilichaam specificiteit, intensiteit en diversiteit. Het protocol beschrijft de complexiteit van dit robuuste gereedschap en biedt een basis richtlijn voor degenen die het antwoord op Neu5Gc dieet koolhydraatantigen in diverse klinische monsters in een matrixformaat willen onderzoeken.
Inleiding
Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen 1 en correleert met progressie en / of metastase 2 , 3 . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc 2 . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als 'zelf', afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsm....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Human Sera-monsters werden verkregen uit de Israëlische Bloedbank en werden gebruikt in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en Tel Aviv University Institutional Review Board.
1. Array Fabrication Planning en Layout
- Bepaal de dia-indeling.
OPMERKING: Elke dia bevat 16 sub-arrays verdeeld in 16 identieke blokken genummerd B1 tot B16 ( Figuur 1B , Aanvullend Figuur 1A ). - Bepaal de pin lay-out. Gebruik vier pinnen, elk afdrukken van vier sub-arrays (blokken) per dia:
Pin 1 afdrukken Blokken 1, 2, 9 en 10;
Pin 2 afdrukken Blokken 3, 4, 11 en 12;....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Array Printing, Development en Analysis:
Het afdrukken van een sialoglycan microarray met meerdere glycanmonsters en menselijke IgG STD-curven in 16 verschillende blokken vereist een grondige kalibratie om ervoor te zorgen dat alle monsters zo uniform mogelijk in alle 16 blokken per dia en op alle dia's in dezelfde afdrukcyclus worden gedrukt. Daarom zijn meerdere kalibreringsexperimenten nodig voordat de specifieke drukparam.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een succesvolle glycan microarray fabricage vereist een zorgvuldige planning en bevat diverse belangrijke stappen in het protocol. Deze omvatten: (1) het plannen van de blok- en plaatlayouts die alle volgende parameters bepalen ( bijv. Afstanden, afstand, hoeveelheid monsters en afdrukken); (2) het schoonmaken van de pennen en het waarborgen van de pin integriteit, die van cruciaal belang is voor het controleren van spot homogeniteit; (3) het handhaven van hoge vochtigheid tijdens het printen, kritisch om vermi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Research Career Development Award van het Israël Cancer Research Fund, een subsidie van het Israëlische National Nanotechnology Initiative en het Helmsley Charitable Trust voor een focal technologiegebied op Nanomedicines for Personalized Theranostics (VP-K) en National Instituten van Gezondheidstoelaag R01GM076360 (naar XC).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Primary-amine bevattende sialoglycanen | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Neem contact op met info@glycohubusa.com voor compound verzoeken | Gedrukte glycanen |
| Mononatriumfosfaat monohydraat | Sigma | S9638 | Print buffer component |
| Dinatriumfosfaat heptahydraat | Sigma | S9390 | Print buffer component |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Hy-Labs | BP-507/500D | Print buffer/ incubatie/was buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blokkeringsreagens |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Print buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blokkeringsreagens |
| Ovalbumine (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide blokkeringseiwit |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide wasmiddel |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker op array |
| ChromPure Human IgG, volledig molecuul | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Print component |
| Biotinyleerde- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant leukeen – binding Sia-alpha2–6-gekoppeld |
| Biotinyleerde-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant leukeen – binding Sia-alpha2–3-gekoppeld |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primaire detectie |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotine binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secundaire detectie tegen human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secundaire detectie tegen chicken IgY |
| Humane serum monsters | Israëlische Bloedbank | Primaire detectie | |
| Gecomprimeerde stikstof (Grade 5) | Algemeen stof-/drooginstrument | ||
| Epoxy-gecoate slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-gecoate slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. Bij dit type slides is het oppervlak meer hydrofoob (in vergelijking met Corning slides), daarom moet de glycanen Print Buffer worden aangevuld met 0,005% Tween-20 om 100 µm grootte spots te verkrijgen. |
| 384-well microtiterplaat | Genetix | 2070 | Printplaat |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labelen |
| Vlekbad | ArrayIt | MST | Slide ontwikkeling tool |
| Vlekbad | VWR | 25608-904 | Slide ontwikkeling tool |
| Slides glazen houders | VWR | 631-9321 | Slide ontwikkeling tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Print pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide ontwikkeling module |
| Gedistilleerde water | Bio-Lab | 2321020500 | Vereist voor arrayer en bevochtiger |
| Elektronische Multi Pipette, 8 Kanaal, volumebereik 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pipette voor monsters in de 384-well plaat te verdelen |
Referenties
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and resp....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
