Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Summary

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Abstract

As células são cobertas com um manto de cadeias de carboidratos (glicanos) que é comumente alterado em câncer e que inclui variações na expressão do ácido siálico (Sia). Estes são os açúcares ácidos que possuem uma espinha dorsal de 9 carbonos e que captam vertebrados de glicanos nas superfícies celulares. Duas das principais formas Sia em mamíferos são o ácido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e sua forma hidroxilada, ácido N- glicolneuraminico (Neu5Gc). Os seres humanos não podem produzir Neu5Gc endógeno devido à inativação do gene que codifica a hidroxilase de cianina 5'-monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). O Neu5Gc estrangeiro é adquirido por células humanas através do consumo dietético de carne vermelha e produtos lácteos e, posteriormente, aparece em glicanos diversos na superfície celular, acumulando-se principalmente em carcinomas. Consequentemente, os seres humanos possuem anticorpos anti-Neu5Gc circulantes que desempenham vários papéis no câncer e outras doenças mediadas por inflamação crônica e que estão se tornando potenciais diagnósticos e terapêuticosRgets. Aqui, descrevemos um ensaio de microarrays de sialoglicano de alto rendimento para avaliar esses anticorpos anti-Neu5Gc nos soros humanos. Os glicanos que contêm Neu5Gc e seus pares de controles correspondentes (glicanos contendo Neu5Ac), cada um com uma amina primária do núcleo, estão ligados covalentemente a lâminas de vidro revestidas com epóxi. Nós exemplificamos a impressão de 56 slides em um formato de 16 poços usando uma nano-impressora específica capaz de gerar até 896 arrays por impressão. Cada slide pode ser usado para exibir 16 amostras de soros humanos diferentes para a avaliação da especificidade, intensidade e diversidade de anticorpos anti-Neu5Gc. O protocolo descreve a complexidade desta ferramenta robusta e fornece uma orientação básica para aqueles que visam investigar a resposta ao antígeno de carboidratos dietéticos Neu5Gc em diversas amostras clínicas em um formato de matriz.

Introduction

Sias são açúcares ácidos que cobrem as cadeias de glicano nas glicoproteínas de superfície celular e glicolípidos em vertebrados. A expressão de Sia é modificada em células cancerosas ¹ e correlaciona-se com progressão e / ou metástase ^{2 , 3} . Duas das principais formas Sia em mamíferos são Neu5Ac e sua forma hidroxilada, Neu5Gc ² . Os seres humanos não podem sintetizar Neu5Gc devido a uma inativação específica do gene que codifica a enzima CMAH. Este Sia não-humano incorpora metabólicamente em células humanas como "auto", provenientes de alimentos ricos em mine....

Protocol

Foram obtidas amostras de soros humanos do Banco de sangue israelense e foram utilizadas de acordo com a Declaração de Helsínquia e o Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Tel Aviv.

1. Array Fabrication Planning and Layout

1. Determine o layout do slide.
   NOTA: Cada slide contém 16 sub-arrays divididos em 16 blocos idênticos numerados B1 a B16 ( Figura 1B , Figura Suplementar 1A ).
2. Determine o layout do pino. Use quatro pinos, cada impressão quatro sub-arrays (blocos) por slide:
   O Pin 1 imprime os blocos 1, 2, 9 e 10;
   O Pin 2 imprime os blo....

Results

Array Printing, Development and Analysis:

A impressão de um microarray de sialoglicano com múltiplas amostras de glicano e curvas de IgG STD humanas em 16 blocos diferentes requer uma calibração completa para garantir que todas as amostras sejam impressas o mais uniformemente possível em todos os 16 blocos por slide e para todos os slides na mesma execução de impressão. Portanto, são necessários vários experimentos de calibração .......

Discussion

Uma fabricação de microarrays de glicano bem-sucedida requer um planejamento cuidadoso e inclui várias etapas importantes no protocolo. Estes incluem: (1) planejar os layouts de blocos e placas que definem todos os parâmetros subseqüentes ( por exemplo, distâncias, espaçamento, quantidade de amostras e impressão); (2) limpar os pinos e garantir a integridade do pino, o que é crítico para controlar a homogeneidade do ponto; (3) mantendo alta umidade durante a impressão, crítica para evitar a evaporação da amostr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amina primária contendo sialoglycans	Glycohub, Inc., Davis, CA, EUA (http://www.glycohub.com/services)	Entre em contato info@glycohubusa.com para solicitações de compostos	Glicanos impressos
Fosfato monossódico monohidratado	Sigma	S9638	Componente tampão de impressão
Fosfato dissódico heptahidratado	Sigma	S9390	Componente tampão de impressão
Fosfato solução salina tamponada	Hy-Labs	BP-507/500D	Tampão de impressão/incubação/tampão de lavagem
Tris-base	Sigma	T1503	Reagente bloqueador de lâminas
Glicerol		Sigma G-7893	Componente tampão de impressão
Etanolamina	Thermo-Fisher Scientific	0700/08	Reagente bloqueador de lâminas
Ovalbumina (Grau V)	Sigma	A5503	Proteína de bloqueio de slides
Tween-20	Sigma	P7949	Detergente de lavagem deslizante
Alexa 555-Hydrazide	Thermo-Fisher Scientific	A20501MP	Marcador na matriz
ChromPure Human IgG, molécula inteira	Jackson Immunoresearch	009-000-003	Componente de impressão
Biotinilado- SNA	Vector Laboratories	B-1305	Lectina vegetal – ligação Sia-alpha2– 6-linked
Biotinylated-MALII	Vector Laboratories	B-1265	Plant Lectin – binding Sia-alpha2– 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgY	BioLegend	146903	Detecção primária
Cy3-Streptavidin	Jackson Immunoresearch	016-160-0848	Ligação à biotina
Cy3-anti Human IgG	Jackson Immunoresearch	109-165-088	Detecção secundária contra IgG humano
Cy3-anti Chicken IgY	Jackson Immunoresearch	703-165-155	Secundário detecção contra amostras de soro humano IgY de frango
	Banco de		israelense Detecção primária
Nitrogênio comprimido (Grau 5)			Ferramenta geral de espanagem/secagem
Lâminas revestidas com epóxi	Corning	40044	Lâminas
Revestidas com epóxi	PolyAn	2D 104-00-221	Slides. Neste tipo de lâminas, a superfície é mais hidrofóbica (em comparação com as lâminas de retirada do núcleo), portanto, o tampão de impressão de glicanos precisaria ser complementado com 0,005% de Tween-20 para obter 100 µ Manchas de tamanho M.
Placa de microtitulação de 384 poços	Genetix	2070	Placa de impressão
Marcador de laboratório VWR	VWR	52877-310	Etiquetagem de lâminas
Matriz de tubos de coloração	MST		Ferramenta de revelação de lâminas
Banho de coloração	VWR	25608-904	Ferramenta de revelação de lâminas
Suportes de vidro de lâminas	VWR	631-9321	Ferramenta
de revelação de lâminasGenePix Scanner	Dispositivos moleculares	4000B	Scanner de slides
LM-60 NanoPrinter	ArrayIt	LM-60	Array impressora
Pins	ArrayIt	946MP3	Pinos de impressão
ProPlate Module	Grace Bio-Labs	P37004	Módulo de desenvolvimento de slides
Água destilada	Bio-Lab	2321020500	Necessário para arrayer e umidificador
Multi Pippete eletrônico, 8 canais, faixa de volume 2-125 μ L	Thermo-Fisher Scientific (Matrix)	MA-2131 Impact2 Equalizer 384	Multi pippete para descarte de amostras em placa de 384 poços