Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements
Summary
Ce protocole vise à évaluer l’effet des facteurs pro – et anti – migratory sur la migration cellulaire dans une matrice de fibrine en trois dimensions.
Abstract
Actuellement, la plupart in vitro des modèles de la cicatrisation, notamment des essais de gratter bien établies, impliquent l’étude cell migration plaie fermeture et sur une surface à deux dimensions. Cependant, l’environnement physiologique dans lequel in vivo de cicatrisation se déroule est en trois dimensions plutôt que deux dimensions. Il devient de plus en plus évident que le comportement cellulaire diffère grandement en deux dimensions par rapport à des environnements en trois dimensions ; par conséquent, il y a un besoin pour plus physiologiquement pertinents en vitro modèles pour l’étude des comportements de migration cellulaire dans la fermeture de la plaie. La méthode décrite ici permet l’étude de la migration cellulaire dans un modèle en trois dimensions qui reflète mieux les conditions physiologiques que tests gratter deux dimensions précédemment établies. Ce modèle vise à évaluer l’excroissance cellulaire par l’intermédiaire de l’examen de la migration cellulaire loin un sphéroïde de corps incorporé dans une matrice de fibrine en présence de facteurs de pro – ou anti – migratory. En utilisant cette méthode, excroissance cellulaire du corps sphéroïdes dans une matrice tridimensionnelle peut être observée et est facilement quantifiable au fil du temps via fond clair microscopie et analyse d’une partie du corps sphéroïde. L’effet de facteurs pro-migrateurs et/ou inhibitrices sur la migration cellulaire peut également être évaluée dans ce système. Cette méthode fournit aux chercheurs avec une méthode simple d’analyse de la migration cellulaire dans la plaie tridimensionnelle associée matrices in vitro, ce qui accroît la pertinence de in vitro cellule études avant l’utilisation d’in vivo de l’animal modèles.
Introduction
La cicatrisation est un processus complexe qui se traduit par la restauration de l’intégrité des tissus après une blessure. Cette démarche est subdivisée en quatre étapes qui se chevauchent par hémostase, inflammation, prolifération et le remodelage, qui font chacun l’objet par une combinaison complexe de signaux solubles, interactions cellule-matrice et les cellules communications. 1 , 2 l’orchestration de ces repères gère une multitude de réactions cellulaires dans la cicatrisation des plaies dont, surtout, la migration cellulaire. 3 , 4 la migration cellulaire est un processus très dynamique dépendant sur les propriétés biochimiques et biophysiques du milieu extracellulaire et les phénotypes cellulaires. 5 cellules sonder en permanence leur environnement de matrice extracellulaire par des voies induite par l’intégrine ; Ce processus permet aux cellules de détecter une large gamme de propriétés de la matrice dont la topographie, de rigidité et de confinement. Bidimensionnelle (2D) analyse de la migration cellulaire démontre que la migration est entraînée par formation de lamellipodia à la pointe grâce à la génération de faisceaux de filaments d’actine. Formation subséquente des adhérences focales à la fine pointe, en combinaison avec l’actomyosine piloté par la contraction et la rentrée sur le bord de fuite, pousse la cellule vers l’avant. 6 la migration cellulaire tridimensionnelle (3D) n’est actuellement pas bien comprise, cependant, des études récentes démontrent que la migration 3D est nettement différente de l’afore décrit le mécanisme en 2D et est probablement entraînée par des mécanismes altératif. Par exemple, des études récentes par Petrie et al. démontré que, en fonction des propriétés de l’ECM, cellules dans des matrices 3D peuvent basculer entre lamellipodium et lobopodium par les mécanismes de la migration. 7 migration cellulaire étant un élément essentiel de la réponse de cicatrisation, des modèles 3D de la migration cellulaire sont essentiels pour la compréhension des réponses physiologiques à divers stimuli pendant la cicatrisation. Bien que le comportement migrateur cellule sur une surface 2D s’est avéré varient considérablement d’un migration dans des matrices 3D, des modèles in vitro plus actuels de la migration cellulaire durant la processus, y compris le dosage zéro bien établi, de cicatrisation utilisent 2D cultures monocouches. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 tests développés plus récemment ont utilisé une matrice 3D, mais encore la culture des cellules dans une monocouche sur le dessus de la matrice, ce qui limite la possibilité de véritablement récapituler la tridimensionnalité de l’environnement de la cellule in vivo. 15
Le but de la méthode décrite ici est d’étudier la migration cellulaire dans un modèle 3D physiologiquement pertinent, plutôt que sur une surface 2D, afin d’acquérir une compréhension plus robuste de réponses de migration associés avec les stimuli appliqués. Cette méthode permet l’évaluation de la migration cellulaire dans une matrice de caillot de fibrine 3D en présence de facteurs qui activer ou inhiber les voies associés à la migration cellulaire. Une matrice de fibrine a été choisie pour cette méthode en raison du rôle critique fibrine joue dans les premiers stades de la cicatrisation des plaies ; après une blessure, un caillot de fibrine est formée dans les environnements de la plaie pour enrayer la perte de sang et sert comme un échafaudage pour l’infiltration de la cellule initiale au cours de la réparation des tissus et le remodelage. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en outre, fibrine est utilisé en clinique comme mastic chirurgical et la composition de l’étanchéité a été liée à la migration cellulaire et ultimate résultats de guérison. Une étude antérieure par Cox et al. a étudié la migration des fibroblastes avec caillots de fibrine composés de fibrine variable et des concentrations de thrombine pour optimiser une fibrine. Dans ces études, la migration des cellules hors les caillots de fibrine sur la vaisselle en plastique a été quantifiée. 20 nous présentons ici une méthode qui permet à la quantification de la migration des cellules dans l’environnement 3D de fibrine. Tandis que la méthode décrite dans le présent protocole spécifiquement utilise fibrine, ce modèle peut facilement être modifié pour utiliser des matériaux à matrice alternative comme vous le souhaitez, comme le collagène ou d’autres matrices 3D. En outre, nous présentons l’utilisation des sphéroïdes de fibroblastes dans ce test parce que la migration des fibroblastes dans le lit de la plaie est d’une importance primordiale à la synthèse de la matrice extracellulaire et réparation/remodelage des tissus. Cependant, au cours de la réparation processus neutrophiles sont le premier type de cellule à migrer dans le lit de la plaie, suivi par les macrophages. Fibroblastes commencent alors à s’infiltrer dans l’environnement de la plaie environ 48 heures après la lésion initiale, au début de la phase proliférative de la processus de cicatrisation. 19 ce dosage peut être facilement modifié pour inclure les neutrophiles, les macrophages ou autres types de cellules afin d’évaluer l’incidence des altérations de structure de caillot de fibrine sur migration de ces types de cellules. 21
Pour implémenter ce dosage, tout d’abord, un sphéroïde de fibroblastes se forme à l’aide d’une modification des techniques décrites précédemment pour la culture de cellules souches. 22 la sphéroïde de fibroblastes est transférée par la suite dans une matrice de fibrine 3D et excroissance ensuite facilement surveiller et quantifié sur plusieurs jours. Ce protocole prend en compte la 3D des systèmes physiologiques en incorporant des sphéroïdes cellule 3D au sein d’une matrice de fibrine, évitant ainsi les limitations en pertinence provoquée par un en utilisant une surface de croissance 2D avec une monocouche de cellules au comportement migratoire de modèle, tandis que en permettant l’évaluation du comportement des cellules dans un milieu hautement contrôlé en vitro .
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet l’examen de la migration cellulaire dans la cicatrisation des plaies entraînées SEGDA via un modèle 3D in vitro . Une étape cruciale dans la bonne exécution de la procédure est le bon développement des sphéroïdes de fibroblastes ; la concentration cellulaire au cours de la préparation a été optimisée pour donner une concentration initiale de 2 500 cellules/drop, permettant des sphéroïdes à forme fiable sur une période d’incubation de 72 h. Si un nombre suffisant de cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financement de ce travail a été fourni par le biais de l’American Heart Association (16SDG29870005) et la North Carolina State University Research et le financement de démarrage de l’Innovation.
Materials
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
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