Dette arbejde præsenterer en ny behandlings- og billedprotokol for tykt, tredimensionelt vævs tværsnit analyse, der muliggør fuld udnyttelse af konfokale billeddannelsesmodaliteter. Denne protokol bevarer antigenicitet og repræsenterer et robust system til analyse af hudhistologi og potentielt andre vævstyper.
Behandling af et væv af interesse for at frembringe et mikroskopisk billede, der understøtter et videnskabeligt argument, kan være udfordrende. Købet af mikroskopiske billeder af høj kvalitet er ikke helt afhængig af mikroskopets kvalitet, men også på vævsprocessens metoder, der ofte involverer flere kritiske handlinger eller trin. Desuden repræsenterer mesenkymceller i huden og andre væv en ny udfordring til vævsfremstilling og billeddannelse. Her præsenterer vi en komplet proces, fra vævshøst til mikroskopi. Vores teknik, kaldet "vandret hele mount", er, at nybegyndere hurtigt kan blive dyktige i og det giver mulighed for antigenbeskyttelse og detektion i 60-300 μm tykke sektioner skåret med en kryostat. Afsnit af denne tykkelse tilvejebringer forbedret visualisering af vævs-mikroarkitektur i et tredimensionelt miljø. Derudover bevarer protokollen mesenchymceller på en måde, der forbedrer billedkvaliteten, nårSammenlignet med standardkryostat eller paraffinsektioner, hvorved effekten og pålideligheden af immunfarvning øges. Vi mener, at denne protokol vil gavne alle laboratorier, der visualiserer hud og eventuelt andre væv og organer.
Revolutionen af mikroskopisk billeddannelsesudstyr giver mulighed for sofistikerede billeddannelsesinstrumenter med høj opløsning. Men når man erhverver et mikroskopisk billede af et komplet tredimensionalt (3D) vævs tværsnit, giver prøvepræparation betydelige udfordringer og kan være den begrænsende faktor ved at definere billedkvalitet. Hvert særskilt trin fortjener omhyggelig overvejelse for at bevare vævsmorfologi og antigenicitet af målproteiner, for at minimere behandlingsinducerede genstande og for at maksimere den endelige billedkvalitet. For eksempel kræver den traditionelle hudanalyse et billede med epidermis og dermis med hårfollikler, der er korrekt orienteret, hvilket giver mulighed for den anatomiske analyse af stamcellekammerbidrag til hudhomeostase 1 , 2 . Dette kræver grundig koncentration om, hvordan huden er indlejret og sektioneret. Det er vigtigt, at hårsækkene kan være tykkereEnd 100 μm, hvilket i høj grad overstiger standardparafinen eller den frosne sektionstykkelse, hvilket resulterer i en lavere analysemetode sammenlignet med hele monteringer eller tykke tværsnit 3 , 4 , 5 .
Tværtimod er hvert trin i prøvepræparation til mikroskopisk analyse en kritisk determinant, som vil påvirke billedanalyse. Her præsenteres en ny behandlingsprotokol til tykt, 3D-vævs-tværsnitsanalyse, som vi kalder "vandret hele mount". Protokollen bevarer meget antigenicitet og muliggør fuld udnyttelse af tykke hudafsnit ved hjælp af standard konfokal billeddannelsesudstyr. Dette er en komplet vejledning til brug af hud til tykt vævs tværsnit behandling og billeddannelse, herunder vævshøst og paraformaldehyd (PFA) -assistent cryopreservering (trin 1), dannelsen af 100 μm tykke vævs tværsnit med en kryostat (trin 2) Og immunfluorescerende mærkning og montering (trin 3 og 4). De repræsentative resultater sammenligner konfokale billeder af to forskellige histologiske forberedelsesteknikker-klassisk kryosektion og tykt 3D-tværsnit af tværsnit, der fremhæver fordelene ved "horisontale hele monteringer" for den potentielle bruger af denne protokol.
Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10.
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender sponsorering fra Thermo-Fisher Scientific og takker Nikon Imaging Center på Kings College London for support under konfokal billedkøb.
PBS | homemade | ||
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
100mm Culture dishes | |||
Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
pointed metal forceps | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
Dissecting microscope | Nikon | ||
20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
Rocking shaker plate | |||
Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
Confocal microscope | Nikon |