Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays
Summary
Здесь мы представляем адресно капелька microarrays (ЗРК), капелька массива на основе метода определить абсолютное белка изобилия в одиночных клетках. Мы демонстрируем ADMs возможность характеризовать гетерогенность в выражении опухолевые супрессоры белок р53 в человеческих раковых клеток линии.
Abstract
На уровне населения, где ответы многих клеток объединяются вместе, как средний результат, маскирование поведение богатых одну ячейку в пределах комплекса населения анализируются поведению часто клеток и клеточных реакций. Технологии обнаружения и количественного определения белка одноклеточных сделали замечательное влияние в последние годы. Здесь мы описываем практический и гибкий одноклеточного анализа платформу, основанную на microarrays адресно капелька. Это исследование описывает, как абсолютная копия количество целевых белков могут быть измерены с резолюцией одной ячейки. Наиболее часто мутировавший ген p53 усмирителя тумора в человека рак, с более чем 50% случаев всего рака экспонируется шаблон выражения не здоровый p53. Протокол описывает шаги для создания 10 nL капель, в рамках которых одного человека раковые клетки изолированы и копировать количество белка р53 измеряется с одной молекулы резолюции точно определить вариабельность в выражении. Этот метод может применяться в любой тип клеток, включая первичный материал для определения абсолютной копией количество любого целевого протеинов интереса.
Introduction
Цель этого метода необходимо определить различия в изобилии целевого белка в популяции клеток с резолюцией одну ячейку. Одноячеистый анализ обеспечивает ряд преимуществ, которые не доступны с традиционными ансамбль биохимические методы. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 во-первых, работа на уровне одной ячейке может захватить богатые гетерогенность популяции клеток, которые в противном случае будут потеряны путем усреднения что происходит с традиционными ансамбль биохимических методов. Большинство биохимических методов работы лошади работают с навалом, требующие, как они часто делают, миллионы клеток для получения результата. Конечно последствия оценки всей клеточных популяций зависит от целого ряда факторов, например, неоднородности в выражении протеина, где могут быть пропущены некоторые важные функции распределения плотности залегания белка. С практической точки зрения чувствительность, требуемых от одноклеточного методов сделать их способен работать с объемами биологического материала, который является недостаточным для даже более чувствительных методов массовых функционировать. Ключевым примером этого является исследование типов редких клеток как циркулирующих клеток опухоли (CTCs), где даже для пациентов с плохой прогностические outlook менее чем 10 CTCs могут присутствовать в одном 7,5 мл крови обратить. 6 . здесь мы представляем методологии, необходимые для выполнения одноклеточного белка измерений с помощью уменьшения объема на основе антител пробирного найма на капельки нефти максимум напечатаны на антитело microarray.
Microfluidic капелька платформы являются высокая пропускная способность, способны генерировать тысячи капель в секунду и способных изолировать и даже культивирования, единичных клеток в отдельные капельки для выполнения широкого спектра биохимических анализов. Методы, основанные на капельки хорошо подходят для анализа одной ячейки,7,8,9 с примечательных недавних примеров, включая DropSeq10 и inDrop11, которые значительно способствовало власть усиление методов. Ограниченное количество материала и не методы усиления белки сделать одну ячейку протеомики особенно сложным.
Капельки могут быть проанализированы ряд методов и широко используется микроскопии флуоресцирования. Одной молекулы методы, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) позволяет флуоресцентных молекул, чтобы быть визуализированы с непревзойденной соотношение сигнал шум. 12 вследствие экспоненциального распада затухающих поля, только флуорофоров в высокой близости к поверхности (порядок 100нм) рады сделать TIRF хорошая стратегия для обнаружения небольших количеств молекулой цели в сложной смеси. Присущие оптических секущей сила TIRF также помогает избегать шагов, мыть и ограничения анализа времени и сложности. Однако TIRF требует плоских поверхностей и примеры TIRF микроскопии, применяется к капельки в потоке включают формирование плоской поверхности которого изображение. 13 с этой целью одну ячейку proteomic методы часто дизайн microfluidic фишки вокруг поверхности прикол захвата агентов в формате microarray. 4 , 14
Капельки, сами, могут быть сформированы в массивах на плоских поверхностях, так называемые капельки microarrays. 15 , 16 , 17 пространственно организовать капельки в массивы позволяет им удобно индексируются, легко контролироваться с течением времени, индивидуально рассмотрены и, если требуется извлечь. Капелька microarrays можно добиться высокой плотности микро-реакторов с тысячами элементов на чип, которые свободно стоящих или поддержанный микрорезервуар структур. 18 , 19 , 20 , они могут быть сформированы осаждением последовательных жидкой обработке роботов, струйный корректировщиков, свяжитесь с microarrayers21,,2223,24,25, 26 , или они могут самостоятельно собрать на таких поверхностях как superhydrophillic пятна узором на superhydrophobic поверхности. 27 , 28 , 29
С учетом этих соображений адресуемых капелька Microarrays (ЗРК) были призваны объединить универсальность, пространственные возможности адресации и сокращение объемов капелька microarrays с чувствительность микроскопии TIRF одной молекулы в количественном мера белка изобилия. 5 ADMs включить анализ одной ячейки, образуя microarray капли, содержащие отдельные ячейки над microarray антитела, которые затем покрытые маслом для предотвращения испарения. Объем капли дискретные для предотвращения потери образца, которая в противном случае может быть достигнуто путем на чипе запорной арматуры в непрерывный поток микрофлюидика. 30 абсолютное количество целевого белка из одной клетки крайне мала; Однако сокращение объема капель позволяет относительно высокой концентрацией местных с тем, чтобы они обнаруживаются с помощью анализа антител сэндвич – антитела иммобилизованных в собственный регион, или пятно, на поверхности, которая захватывает белка, который в свою очередь связывается для дневно помечены обнаружения антител в объем капли. Как лейбл свободный подход (то есть белок, цели не обязательно должны наноситься непосредственно), ЗРК обычно применяется для анализа клеток из первичных источников, таких, как обработанные крови, отлично нужно пунктаты и биопсий диссоциированных опухоли, а также клетки от культуры и их лизатов.
Измерение различий в изобилии белка по всей популяции клеток имеет важное значение при определении гетерогенность в ответ, например, наркотиков и поможет в предоставлении проницательность в клеточных функций и тропинки, оценки субпопуляций и их поведение, а также выявления редких событий, которые бы в противном случае быть замаскированы методы массового. Этот протокол описывает, как производить и использовать адресный капелька microarrays количественно определить обилие p53 фактор транскрипции в человеческих раковых клеток и могут быть использованы для изучения роли p53 в ответ химиотерапевтических препаратов. Целевого белка определяется выбором захвата и обнаружения антител и может быть изменен для включения более или различные цели. Инструкции для создания простой аппарат, включающий концентрических сопло из общего Лаборатории расходные материалы для вручную массив 10 капель nL, покрытые маслом. Полный экспериментальный процесс описан в соответствии с которым каждая капелька затем загружается с одну ячейку, которая затем лизированы и выражения протеина, определяется с одной молекулы резолюции, с помощью микроскопии TIRF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Адресный капелька Microarrays являются чувствительными и расширяемый метод количественного определения абсолютной копией количество белка в одной ячейке.
Ограничение уровня неспецифической привязки (NSB) имеет решающее значение в рамках протокола для достижения как низкий ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR разработан эксперименты, разработали протоколы и анализировали данные. СК и СП выполненных экспериментов размер ячейки. ASR и OC написал рукопись. Авторы хотели бы с благодарностью отметить поддержку профессор Дэвид р. Klug за предоставление доступа к оборудованию. Авторы хотели бы поблагодарить Императорского расширенный Hackspace колледж для доступа к изготовлению и прототипов.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
