Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.
Abstract
Oft zellulären Verhalten und zelluläre Reaktionen auf Bevölkerungsebene analysiert, wo die Antworten aus vielen Zellen als ein durchschnittliches Ergebnis Maskierung der reichen einzelne Zelle Verhalten innerhalb einer komplexen Population zusammengefasst sind. Einzelne Zelle Protein Erkennung und Quantifizierung Technologien haben in den letzten Jahren einen bemerkenswerten Einfluss gemacht. Hier beschreiben wir eine praktische und flexible Einzelzelle Analyse-Plattform basierend auf adressierbaren Tröpfchen Microarrays. Diese Studie beschreibt, wie die absolute heftnummern Zielproteine mit einzelligen Auflösung gemessen werden können. Der Tumorsuppressor p53 ist das am häufigsten mutierte Gen im menschlichen Krebs, mit mehr als 50 % der insgesamt Krebsfälle Ausstellen eines nicht gesunden p53 Expressionsmuster. Das Protokoll beschreibt die Schritte zum Erstellen von 10 nL Tröpfchen in dem einzigen menschlichen Krebszellen sind isoliert und die Kopienzahl des p53-Protein wird gemessen mit Einzelmolekül-Auflösung, die Variabilität der Ausdruck genau zu bestimmen. Die Methode kann auf jeden Zelltyp einschließlich Primärmaterial zu bestimmen, die absolute Kopienzahl jedes Ziel interessierender Proteine angewendet werden.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist die Variation in Hülle und Fülle an ein Zielprotein in einer Zellpopulation mit einzelligen Auflösung bestimmen. Einzelne Zelle Analyse liefert eine Reihe von Vorteilen, die nicht mit traditionellen Ensemble biochemischen Methoden zur Verfügung stehen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Erstens kann arbeiten auf der Ebene der einzelnen Zelle die reiche Heterogenität einer Zellpopulation, die sonst durch die Mittelwertbildung verloren gehen würde zu erfassen, die mit traditionellen Ensemble biochemischen Techniken auftritt. Die meisten Arbeitspferd biochemischen Methoden arbeiten mit der Masse erfordern, wie sie oft tun, Millionen von Zellen, um ein Ergebnis zu erzielen. Natürlich die Folgen ganze Zellpopulationen zu bewerten hängt eine Reihe von Faktoren, beispielsweise die Heterogenität in Protein-Expression, wo einige wichtigen Funktionen des Vertriebs von Protein Fülle ausgelassen werden können. Aus praktischer Sicht die Empfindlichkeit der einzelnen Zelle Techniken erforderlich machen sie in der Lage, arbeiten mit Mengen von biologischem Material, das für noch empfindlicheren Bulk-Techniken funktionieren nicht ausreicht. Ein wichtiges Beispiel hierfür ist das Studium der seltene Zelltypen wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) wo auch für Patienten mit einer schlechten prognostischen Aussichten ziehen weniger als 10 CTCs in einem einzigen 7,5 mL Blut vorhanden sein könnte. 6 hier präsentieren wir Ihnen die Methodik erforderlich, um einzelne Zelle Protein Messungen mit einem reduzierten Volumen Antikörpern basierende Assays mit Öl-capped Tröpfchen auf ein Antikörper Microarray gedruckt.
Mikrofluidische Tröpfchen Plattformen sind hohen Durchsatz in der Lage, Tausende von Tröpfchen pro Sekunde und in der Lage zu isolieren, und sogar züchten, einzelner Zellen in einzelne Tröpfchen eine Vielzahl von biochemischen Tests durchführen zu erzeugen. Tröpfchen-basierte Techniken eignen sich gut für einzelne Zellanalyse,7,8,9 mit den letzten Beispiele einschließlich DropSeq10 und InDrop11, die stark durch die Kraft des unterstützt worden Verstärkung-Techniken. Die begrenzte Menge an Material und keine Methoden der Verstärkung für Proteine machen einzelne Zelle Proteomics besonders herausfordernd.
Tröpfchen können durch eine Reihe von Methoden analysiert werden und Fluoreszenz-Mikroskopie ist weit verbreitet. Einzelmolekül-Techniken wie Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) können fluoreszierende Moleküle mit unvergleichlicher Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert werden. 12 aufgrund der exponentiellen Zerfall der evaneszenten Feldes sind nur Fluorophore in hohen Nähe an die Oberfläche (Reihenfolge der 100nm) begeistert machen TIRF eine gute Strategie bei der Aufdeckung von kleinen Mengen eines Zielmoleküls in einer komplexen Mischung. Die optische Stationspunkte Eigenfestigkeit des TIRF hilft auch waschen Schritte zu vermeiden und Grenzen bestimmen Dauer und Komplexität. Jedoch, TIRF erfordert planare Flächen und Beispiele für TIRF-Mikroskopie auf Tropfen im Fluss angewendet beinhalten die Bildung einer planaren Fläche davon zu Bild. 13 zu diesem Zweck design-Einzelzelle Proteomic Techniken oft mikrofluidischen Chips Oberfläche immobilisiert Capture-Agenten in einem Microarray-Format. 4 , 14
Die Tröpfchen, selbst können in Arrays auf planaren Flächen, sogenannte Tröpfchen Microarrays ausgebildet sein. 15 , 16 , 17 räumlich organisieren Tröpfchen in Arrays ermöglicht es ihnen, bequem indiziert, leicht im Laufe der Zeit überwacht, individuell angesprochen und bei Bedarf abgerufen. Droplet Microarrays erreichen eine hohe Dichte von Mikroreaktoren mit Tausenden von Elementen pro Chip sind freistehend oder von Microwell Strukturen unterstützt. 18 , 19 , 20 sie können gebildet werden durch sequentielle Abscheidung von liquid Handling-Roboter, Inkjet-Spotter, wenden Sie sich an Microarrayers21,22,23,24,25, 26 , oder sie können selbst-zusammenbauen auf Oberflächen wie Superhydrophillic Flecken gemustert auf einer superhydrophob Oberfläche. 27 , 28 , 29
Mit diesen Überlegungen im Auge wurden adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADMs) entwickelt, um die Vielseitigkeit, räumliche Adressierbarkeit und reduzierten Volumina von Tröpfchen Microarrays quantitativ mit der Empfindlichkeit der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie zu kombinieren Protein-Fülle zu messen. 5 ADMs ermöglichen Einzelzelle Analyse bildet ein Tröpfchen Microarray mit einzelnen Zellen über einen Antikörper Microarray, die dann mit Öl, um Verdunstung zu verhindern begrenzt ist. Die Bände der Tröpfchen sind diskrete Probenverlust, zu verhindern, die sonst durch Ventile auf dem Chip im kontinuierlichen Fluss Mikrofluidik erreicht werden würde. 30 die absolute Menge an Zielprotein aus einer einzigen Zelle ist äußerst gering; Allerdings ermöglicht das geringere Volumen der Tröpfchen für relativ hohe lokale Konzentration, so dass sie erkannt werden, mit einem Sandwich-Antikörper-Assay – Antikörper immobilisiert ist, in eine eigenständige Region oder vor Ort, auf eine Oberfläche, die Protein fängt die wiederum bindet um ein eindringmittel gekennzeichneten detektionsantikörper in Tröpfchen Volumen vorhanden. Als markierungsfreie Ansatz (d.h. Protein Ziele müssen nicht direkt gekennzeichnet werden), ADM-Dateien sind generell für die Analyse von Zellen aus Primärquellen, wie z. B. verarbeitete Blut, gut brauchen Aspiraten und dissoziierten Tumor Biopsien sowie Zellen von Kultur und Ihre Lysaten.
Messung der Variation in Hülle und Fülle Protein in einer Zellpopulation ist wichtig bei der Bestimmung der Heterogenität, z. B. als Reaktion auf ein Medikament und hilft bei bietet Einblick in die Zellfunktionen und Wege, Bewertung von Subpopulationen und ihre Verhalten sowie seltene Ereignisse zu identifizieren, die sonst durch lose Methoden maskiert werden würde. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu produzieren und adressierbare Tröpfchen Microarrays verwenden, um die Fülle der Transkription Faktor p53 in menschlichen Krebszellen quantitativ zu bestimmen und kann verwendet werden, um die Rolle von p53 in Reaktion auf Chemotherapeutika zu untersuchen. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl der Erfassung und Erkennung Antikörper und kann geändert werden, um mehr oder andere Ziele enthalten. Anleitung zum Erstellen einer einfachen Apparatur unter Einbeziehung einer konzentrischen Düse aus allgemeinen Labor Verbrauchsmaterial manuell Array 10 nL Tröpfchen mit Öl bedeckt. Die vollen experimentelle Verfahren ist beschrieben, wobei jedes Tröpfchen dann geladen wird, mit einer einzelnen Zelle, die dann lysiert ist und der Ausdruck des Proteins bestimmt mit Einzelmolekül-Auflösung mit TIRF-Mikroskopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adressierbare Tröpfchen Microarrays sind eine sensible und erweiterbare Methode für quantitativ bestimmen die absolute Kopienzahl des Proteins innerhalb einer einzelnen Zelle.
Begrenzung der Höhe der unspezifischen Bindung ist (NSB) im Rahmen des Protokolls zur Erreichung möglichst geringen maximal Erkennung wie möglich. Proteine und andere biochemische Arten können unspezifisch binden an eine Reihe von Schnittstellen in die Tröpfchen-Deckglas Oberfläche, der Antikörper vor Ort und de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ASR geplante Experimente, Protokolle entwickelt und analysiert Daten. SC und PS durchgeführt Zelle Größe Experimente. ASR und OC schrieb das Manuskript. Die Autoren möchten die Unterstützung von Prof. David R. Klug dankbar anerkennen, für den Zugriff auf Geräte. Die Autoren danken der Imperial College Advanced Hackspace für den Zugriff auf Fertigung und Prototyping Anlagen.
Materials
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6×4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -. N., Guo, R., Cui, H. -. J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. “One cell-one well”: A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip – Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -. X., Liu, W. -. W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -. H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA – Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
