Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at opnå subcellulært protein lokalisering resultater på zebrafisk nethinden af korrelerede super-resolution lysmikroskopi og scanning elektronmikroskopi billeder.
Vi præsenterer en metode til at undersøge subcellulært protein lokaliseringen i larve zebrafisk nethinden ved at kombinere super-resolution lysmikroskopi og scanning Elektron Mikroskopi. Sub diffraktion grænse opløsning kapaciteter af super-resolution lys mikroskoper tillade, forbedre nøjagtigheden af korrelerede data. Kort, 110 nanometer tyk cryo-sektioner er overført til en silicium wafer, og efter immunofluorescens farvning, er afbildet af super-resolution lysmikroskopi. Efterfølgende, er sektionerne bevaret i methylcellulose og platinum skygget før imaging i en scanning elektron mikroskop (SEM). Billeder fra disse to mikroskopi modaliteter flettes nemt ved hjælp af væv vartegn med open source software. Her beskriver vi tilpasset metoden til larve zebrafisk nethinden. Men denne metode er også gælder for andre typer af væv og organismer. Vi demonstrere, at de supplerende oplysninger, som denne korrelation er købedygtig løse udtryk af mitokondrielle proteiner i forbindelse med membraner og cristae af mitochondrier samt andre rum af cellen.
Metoder til at bestemme den subcellulært lokalisering af proteiner og deres forhold til forskellige segmenter af cellen er væsentlige værktøjer til at forstå deres funktioner og mulige interaktioner. Super-resolution mikroskopi i kombination med elektronmikroskopi giver sådanne oplysninger1. Grundtilstand udtynding mikroskopi efterfulgt af enkelte molekyle afkast (GSDIM) er en super-resolution mikroskopi teknologi, kompatibel med en bred vifte af økologiske og genetisk kodet fluorophores2 og opnår en lateral opløsning på op til 20 nm 3. inddragelse af metoder med højere opløsning end standard diffraktion-begrænset mikroskopi forbedrer nøjagtigheden af korrelation4,5,6. For at opnå den bedste korrelation af protein udtryk med en specifik subcellulært rum og reducere mængden af usikkerhed7 anvendelse af den samme ultratynde sektion til lys og elektronmikroskopi anbefales. Blandt de forskellige skære metoder, Tokuyasu cryo-sektion protokollen kræver ikke dehydrering eller harpiks indlejring, og derudover bevarer antigenicity af mange epitoper og giver god væv ultrastruktur8. Flere metoder har vist anvendeligheden af disse sektioner i korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM)4,5,9,10.
Zebrafisk nethinden er en værdifuld model til at studere visuelle udvikling og menneskelige sygdomsmekanismer givet sin yderst velbevarede struktur og funktion på tværs af hvirveldyr. I særlige, retinal fotoreceptorer display den samme arkitektur som pattedyr fotoreceptorer, med en basal synapse, en apico-basen aflang kerne, klynger af mitochondrier i af mere apikale indre og en ydre segment består af membran diske i den mest apikale holdning11. Protein lokalisering til de forskellige cellulære rum er bevaret mellem zebrafisk og menneskelige, giver mulighed for undersøgelse af den biologiske funktion af menneskelig sygdom-relevante proteiner12,13.
Her præsenterer vi en protokol for at forberede larve zebrafisk nethinden prøver at løse lokalisering af den ydre membran protein Tom20 ved korrelationsmaalinger super-resolution lys og elektronmikroskopi. Metoden er baseret på indsamling af cryo-sektioner på silicium wafers og at opnå kontrast ved topografiske oplysninger produceret efter anvendelse af et tyndt lag af platin. Disse trin er klart tekniske forbedringer for lethed af brug, reproducerbarhed og tid til at fuldføre eksperimenter. Vi har for nylig vist anvendeligheden af metoden til at registrere nukleare porer og mitokondrielle proteiner i mus væv14.
Denne metode kombinerer Super-løst protein lokalisering med kontekstafhængige oplysninger til at bestemme den nøjagtige position af proteiner i en organelle. Vi viser her afslutningen af forsøget at visualisere udtryk for Tom20 i den ydre membran af mitokondrier, og dets relation til andre organeller som kerner eller ydre segmenter af fotoreceptor i larve zebrafisk nethinden.
Tokuyasu cryo-skæring kræver nogle uddannelse at erhverve velbevarede sektioner. Dette er dog en metode, der er ansat i mange laboratorier med dokumenteret succes21. Overførsel af sektionerne til silicium wafer er meget enkel og ingen særlige overvejelser er nødvendige. Brugen af glycerol i imaging bufferen er et meget afgørende skridt til at undgå udtørring af sektionerne. For super-opløsning imaging opnås de bedste resultater når wafer er meget tæt på glas bund af petriskålen. Silikone striber hjælpe bevare wafer i denne position. Særlig forsigtig skal der tages samtidig med at fjerne striberne for at undgå at beskadige sektionerne.
Tykkelsen af cryo-sektioner, omkring 100 nm, tyndere end den optisk opløsning i Z-dimension, derudover letter rigtigheden af denne korrelationsmaalinger metode som Super-resolution mikroskopi signal kommer kun fra denne tynde lag og den scanning elektron mikroskop signal viser topografi af prøven. Denne metode kan også kombineres med flerfarvet billeddannelse. Dog skal særlig forsigtig træffes at prøven kan være afbildet under samme betingelser (fx imaging buffer) og krydstale, bør forebygges.
En begrænsning af metoden er dens to dimensionel tilgang, eftersom kun et begrænset antal serielle sektioner (omkring 3-7 per wafer) kan afhentes. Projekter beskæftiger sig med volumen analyse ville således ikke være ideel. Men det er en metode, der kan anvendes til at påvise protein udtryk i enhver type af væv ved enkle skæring af prøven. Vi leverer en metode uden brug af klassisk kontrastmidler som uranyl acetat eller bly citrat. Kontrast af platin shadowing giver meget informative topografiske kontrast, men i nogle tilfælde membraner er vanskelige at løse. Dette kan skabe problemer for projekter, der har brug for for eksempel at fastsætte udtrykket af proteiner i små blærer.
Vores protokol, baseret på Tokuyasu cryo-sektioner, bruger standard udstyr for at opnå korrelationsmaalinger resultater fra super-opløsning og scanning elektron mikroskoper. Samling af sektioner på silicium wafers og brugen af platinum til kontrast er enkle trin til at give stabilitet og reproducerbarhed til prøveforberedelsen.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering ION og RGB: Swiss National Science Foundation Ambizione-SCORE give PZ00P3 142404/1 og PZ00P3 163979.
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
Sucrose | Merck | #1.07687 | |
Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
Glycine | Sigma | #G-7126 | |
Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
Wired loop "Perfect loop" | |||
Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc – 11415 | |
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Instruments | |||
Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
SEM – Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
FIB-SEM – Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |