本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統における法の再現性がテストされました。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
科学とバイオ テクノロジーの現在の傾向は、何千ものそれによって繁殖コロニーを維持する一般的なプラクティスを超える遺伝資源の安全な保管のための新しい方法の必要性につながるモデル有機体内の新しい行の作成に します。本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。初期段階全体精巣生殖細胞の凍結保存わたしを楽しめ、ゼブラフィッシュの貯蔵のため遺伝資源移植後彼らは雄性と雌性の配偶子に成熟することができます特に以来。精巣を摘出、2 凍害メディア (1.5 M メタノールと 1.5 M プロピレング リコール; 平衡ソリューションと 3 M ジメチルスルホキシドと 3 M プロピレング リコールを含むガラス固化ソリューション) で平衡鍼灸針の固定液体窒素に墜落しました。サンプルは、3 つの結果として地球温暖化ソリューションのシリーズで暖められました。この手法の主な利点 (1) 精子の不足は、暖められた精巣のため下流の操作が容易の消化後(2) 超急速冷却液体窒素したがって冷却と凍結保護剤、その毒性を低減の必要濃度の削減を最大化する組織の最適な露出を有効にします。(いくつか精巣の凍結保護剤と液体窒素への露出 3) 同期(4) の再現性は 5 つの異なるゼブラフィッシュ系統で 50% 以上の生存率を得ることによって示されます。
概要
科学とバイオ テクノロジーの新しいトレンドは、マウスやショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ モデル有機体生物医学的でおよび他の科学の1として使用される他種の新しい突然変異系統の何千もの作成につながっています。さらに、新技術の開発し、利用可能になるが、突然変異系統の数は着実に2を増加します。これの繁殖コロニーを維持する一般的な慣行を超えて遺伝資源の安全なストレージの必要性に します。凍結保存を不特定期間の遺伝資源の安全な保管を可能にする方法としては繁殖期の延長は親魚、継続的なメンテナンスの必要性を回避して、それはより多くのコスト-のように多くの利点を提供していて、労働効率2。
過去数年間2,3,4中に開発された精子凍結保存のためのプロトコルは、ゼブラフィッシュ男性遺伝物質の正常なストレージのための機会を提供しています。しかし、卵や魚の胚の凍結保存は、まだ彼らの複雑な構造と卵黄素材の大量のためことはできません。最近では、始原生殖細胞 (PGCs) 精原幹細胞 (Ssc) の移植の実践は機能的な精子や卵子に移植
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ここで説明したすべてのメソッドは、ハンガリー語の動物福祉法によって承認されています。
1. 試薬の準備
- 貯蔵液
- 1 M トレハロースを準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL にトレハロース二水和物の 0.378 g を追加します。
- 1 M ショ糖を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL の中にショ糖の 0.342 g を追加します。
- 1 M HEPES を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL に HEPES の 0.238 g を追加します。
- 100 mg を 5 mL の PBS に追加することによって 20 mg/mL コラゲナーゼ (290 U/mg) を準備します。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結
- 15 mg/mL のトリプシンを準備 (~ 10000 U/mg) 75 mg を 5 mL の PBS に追加することによって。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
平均では、魚の大きさに応じて 40,000 および 200,000 の細胞間単一新鮮なゼブラフィッシュ精巣から分離された初期生殖細胞の数で変化。すべての 5 系統で新鮮なゼブラフィッシュ精巣を消化、初期生殖細胞細胞懸濁液 (図 2) で現在のセルだけがなかった。初期生殖細胞の横に多数の精子がも見つかりました。その一方で、凍結保存した精巣の消化後はるかに少ない精子があった。これは、精子ではこの超高速の冷却プロトコルは生きていけないくらいクリーナー懸濁液が生殖細胞の初期段階をもたらす消化プロセス中に除去と思われることを示した。
3 AB ゼブラフィッシュ男性 (一方通行 ANOVA の新鮮な精巣の消化によって示される単一の個々 の左と右の精巣 (1 ± 0.5 × 105対 1.1 ± 0.7 × 105) 間初期生殖細胞数に有意差はありませんでした。;.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
本研究の主な目的は、針を適応する鳥類と哺乳類10、11,12魚の精巣 (モデルとしてのゼブラフィッシュの凍結保存するために開発された超高速冷却手順を浸漬生物)。ゼブラフィッシュ遺伝子資源の凍結保存に関する従来の研究のほとんどは、ゼブラフィッシュ精子2,3,4の凍結保存に主に集中しました。但し、成熟卵子および胚の凍結保存のためのプロトコルが開発されていないけれども、にもかかわらず、いくつかの最近の研究の初期段階卵子を保存を示す、説得力のある14,15。本研究で我々 はゼブラフィッシュ精原細胞の移植後、彼らは両方の男性と女性の配偶子
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
本研究は、国立の研究、開発および革新ハンガリー オフィス (ÁH にグラント 116912) 費用事務所に支えられ (食品と農業コスト アクション FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奨学金プログラム (ザンビアにグラント)、新ハンガリー国家卓越性また、博士課程フェローシップ (EK にグラント)。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| リーボビッツ培地 (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | L-グルタミン添加 |
| シ胎児血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| トリカインメタンスルホン酸 (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| スクロース | Acros Organics | 57-50-1 | |
| トレハロー | アクロス オーガニックス | 99-20-7 | 二水和 |
| 物メタノール | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| プロピレングリコール | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| ジメチルスルホキシド | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| コラゲナーゼ | Gibco | 9001-12-1 | |
| トリプシン | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| ホスケート緩衝生理食塩水) | Sigma-Aldrich | P4417 | Tablets for preparation of 200 ml PBS solution |
参考文献
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
