Vi rapporterer bruker en kunstig intronic liten RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. En detaljert prosedyre for konstruksjon, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer så vel som for larver infeksjon er beskrevet.
I vivo microinjection er mest brukte genet overføring teknikken for å analysere genet funksjonene i individuelle mygg. Men denne metoden krever en mer teknisk krevende operasjon og innebærer kompliserte prosedyrer, spesielt når de brukes i Larvene deres liten størrelse, relativt tynt og skjøre cuticle og høy dødelighet, som begrenser anvendelsen. Derimot er viral vektorer for gen levering utviklet for å overvinne ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy genet signaltransduksjon effektivitet, langsiktig vedlikehold av genuttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er mygg-spesifikke, liten én-strandet DNA virus som kan effektivt levere utenlandsk nukleinsyrer til mygg celler. imidlertid fører erstatning eller innsetting av utenlandske gener å opprette rekombinant virus vanligvis til tap av emballasje og/eller replikering evner, som er et hinder for utviklingen av disse virusene som levering vektorer.
Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo leveringssystem. Detaljerte fremgangsmåter, emballasje og kvantitativ analyse av rAaeDV vektorer og larver infeksjon er beskrevet.
Denne studien viser, for første gang, muligheten for å utvikle en ikke-defekt rekombinant MDV micro RNA (miRNA) uttrykk system, og dermed gir et kraftig verktøy for funksjonell analyse av gener i mygg og etablere et grunnlag for den anvendelse av viral paratransgenesis for å kontrollere mygg-sykdommer. Vi viste at Aedes albopictus 1st skikkelsen Larvene kan være enkelt og effektivt infisert av introdusere viruset i vannmassen næringsplante avl området og at den utviklet rAaeDVs kan brukes overexpress eller slå ned på uttrykk med et bestemt mål i larvene, gir et verktøy for funksjonsanalyse av mosquito gener.
Mygg-sykdommer som malaria, denguefeber, zika feber og gul feber, er store internasjonale folkehelseproblemer som fortsatt står for en betydelig andel av de globale infeksjonssykdommer byrde1,2. Konvensjonelle insektmidler, som har vært brukt i respons til vektorer, er en viktig komponent i bærekraftig integrert mygg strategi for forebygging av mygg-sykdommer. Men slike strategier har vist seg for å være relativt ineffektiv eller uønsket på grunn av tilknyttede negative miljøvirkninger samt utviklingen av motstand i mygg bestander3,4. For disse grunner, det er et presserende behov for alternative metoder for mygg kontroll og bruk av transgene metoder for å produsere sterilt mannlige mygg og utgivelsen av patogen-resistente mygg har oppstått som lovende nye kontroll strategier. For å utvikle effektive nye kontroll metoder, som sikker og effektiv tilnærminger i vivo gen levering, av mygg gen funksjon er nødvendig.
Direkte microinjection av plasmider DNA, dobbel strandet RNA (dsRNA) eller lite forstyrrende RNA (siRNA) er mest brukte i vivo -genet leveringsmåte i mygg. Faktisk produksjon av transgene stammer av mygg fortsatt stole på en prosess av embryoet microinjection5,6,7. Microinjection har imidlertid flere begrensninger. Først denne teknikken er teknisk krevende og innebærer kompliserte prosedyrer. Andre forårsaker injeksjon en fysisk fornærmelse til fosteret, larver, pupae og voksen, som direkte påvirker levedyktigheten til organismen mål. For det tredje er det vanskelig å nakkens Larvene for microinjection fordi de fleste bor i et akvatisk habitat og har en karakteristisk sprellende bevegelse. Fjerde, 1st-2nd skikkelsen Larvene er 10 – til 20 ganger mindre enn 4th skikkelsen og eldre larver og neglebåndene av det tidligere er mer delikat. Disse funksjonene gjør det vanskelig å manipulere 1st-2nd skikkelsen Larvene sammenlignet med de i eldre stadier. Kombinert, bidra disse faktorene til en redusert etter injeksjon overlevelse for Larvene (ca 5%) sammenlignet med voksne8. Viral-baserte levering systemer er utviklet for å overvinne den tilknyttede ekstracellulære og intracellulær barrierer. Disse systemene har fordelene med enkel manipulering, høy signaltransduksjon effektivitet, langsiktig og robust nivåer av uttrykk og evnen til å produsere vedvarende effekter i vivo. Derfor brukt genet leveringssystemer utnytte retroviruses, lentiviruses og adenoviruses har vært mye inmammalian linjer og modell arter. Sindbis viral uttrykk systemet hadde tidligere blitt brukt analysere funksjonen genet i voksen mosquito; Foruten de biosikkerhet bekymringene, men er injeksjon fortsatt nødvendig for virusinfeksjon9. Selv om muntlig levering av soaking larver i dsRNA løsningen er rapportert tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnet for små RNA funksjonen analyse10. Så, effektiv viral leveringsmåter må fortsatt utvikles for myggen.
Mosquito densoviruses (MDVs) er en del av Densovirinae og Parvoviridae, og alle unntatt én ligger innenfor slekten Brevidensovirus11. MDV virions er ikke innhyllet og består av en enkelt-strandet DNA (ssDNA) genom og en icosahedral kapsid (20 nm i diameter). Viral genomet er ca 4 kb inne størrelse og replikeres i kjerner i verten cellene. MDVs er relativt stabil i miljøet og viser mange smale vert med høy spesifisitet for myggen. Disse virusene har potensial til å spre og vedvarer naturlig mygg bestander og kan invadere nesten alle organer og vev av disse insekter, inkludert midttarmen, Malpighian tubuli, fett kroppen, muskulaturen, nerveceller og spyttkjertler12.
Behold MDV genomer kan være subcloned i plasmider vektorer å produsere plasmider-baserte smittsomme kloner; Når disse Klonene leveres i mygg celler, er viral genomet er Hentet fra plasmider vektoren og smittsomme virus partikler produseres. Fordi MDV har en liten ssDNA genom, smittsomme kloner er enkelt konstruert og viral genomet kan være lett manipulert11,13. Disse egenskapene gjør MDV en verdifull agent for å undersøke mygg biologi. Men fordi nesten alle viral genomet rekkefølgen er viktig for viral spredning, etableringen av rekombinant viruset gjennom erstatning eller innsetting av utenlandske gener forårsaker tap i viral emballasje og/eller replikering evner, som skaper en barriere for utviklingen av MDVs som Gen levering vektorer. Her rapporterer vi bruker en kunstig intronic små-RNA uttrykk strategi for å utvikle en ikke-defekt rAaeDV i vivo RNA leveringssystem som har fordelene med enkel plasmider bygging og vedlikehold av en funksjonell virus som kan produsere stabil og langsiktig uttrykk i vertsceller uten behov for vill-type virus. I tillegg gir denne metoden enkel Albin på larvene.
Protokollene for fremgangsmåten er beskrevet i denne studien: 1) design av rAaeDVs koding en intronic liten-RNA uttrykk kassett, 2) produksjon av rekombinant viruspartikler med C6/36 emballasje cellen linje, 3) kvantitativ analyse for celle-fri rAaeDV genomet kopiere tall og 4) infeksjon i Ae. albopictus larver av direkte innføring av virus i selve vann larver habitat. Samlet vist denne arbeid at bestemte små RNAs eller mål gener kan overexpressed og slått ned i Larvene bruker utviklet MDV leveringssystem.
Det er viktig å overvinne to av de viktigste hindringene som begrenser rAaeDV konstruksjon. Først er produksjon av defekte rekombinant virus. Det har blitt rapportert at MDV kan brukes som en vektor uttrykke riktig størrelse utenlandske gener, som scorpion insekt-spesifikke neurotoxins20 og GFP protein; men uansett konstruksjon strategi form når ORFs MDV er satt inn eller erstattet med eksogene gener, virions ikke uavhengig med mindre en hjelper plasmider er cotransfected for å levere manglende uunnværlig virale pr…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter økonomisk støtte fra National nøkkelen forskning og utvikling Program i Kina (2016YFC1200500 til Xiao-Guang Chen), National Natural Science Foundation av Kina (81672054 og 81371846), naturlige forskningsprogram Team Science Foundation i Guangdong (2014A030312016), og vitenskapelige og teknologiske programmet Guangzhou (201508020263). Vi erkjenner takknemlig Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) for vennlig gir pUCA og p7NS1-GFP plasmider og kritisk lesing dette manuskriptet.
Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 21875109 | |
Fetal Bovine Serum( Australia Origin) | Gibco, Life Technologies | 10099141 | |
penicillin/streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15070063 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen,Life Technologies | 11668019 | |
Proteinase K | Promega | MC5008 | |
DNase I (RNase-free) | Invitrogen,Life Technologies | AM2222 | |
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |