Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용
Summary
이 프로토콜은 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 음성 염색 바이러스 샘플을 제공합니다. 여기에는 투과 전자 현미경 그리드를 보호하고 생체 내에서 난기류 환경에서 사용자가보다 쉽게 취급 할 수있게 해주는 혁신적인 가공 캡슐의 사용이 포함됩니다.
Abstract
Transmission electron microscopy (TEM)는 나노 미터 해상도의 바이러스 및 기타 미생물 병원체의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 대부분의 생물학적 물질은 전자를 산란시켜 이미지를 생성 할 수있는 조밀 한 요소를 포함하지 않습니다. 따라서 시료 주위에 짙은 중금속 염을 포함하는 음성 염색이 필요합니다. TEM 하에서 현탁액에서 바이러스를 가시화하기 위해서는 나노 미터 두께의 투명한 표면으로 코팅 된 작은 그리드에 적용해야합니다. 크기가 작고 부서지기 쉽기 때문에이 그리드는 취급하기가 어렵고 기류로 쉽게 움직일 수 있습니다. 얇은 표면은 쉽게 손상되어 이미지를 어렵게하거나 불가능하게 만듭니다. 감염성 바이러스는 생물 안전성 캐비닛 (BSC)에서 처리해야하며 일부는 생물학적 환경 실험실 환경이 필요합니다. 특히 생물 안전성 수준 (BSL) -3 및 -4로 바이러스를 염색하는 것은 이러한 환경이 더욱 난기류이며 기술자가 필요하기 때문에 특히 어려움o 손재주를 감소시키는 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
이 연구에서 우리는 생물학적 성취에서 음성 염색 바이러스를 돕기위한 새로운 장치를 평가했습니다. 이 장치는 전문 피펫 팁으로 작동하는 캡슐입니다. 그리드가 캡슐에로드되면 사용자는 간단하게 캡슐에 시약을 흡인하여 캡슐화 된 그리드에 바이러스와 얼룩을 전달하여 그리드의 사용자 처리를 제거합니다. 이 기술은 BSL-3 또는 -4 생체 적합에 사용하기 위해 특별히 설계되었지만 바이러스의 음성 염색을 용이하게하여 모든 실험실 환경에서 시료 준비를 쉽게 할 수 있습니다. 이 같은 방법은 나노 입자, 거대 분자 및 유사한 표본의 음성 스테인드 TEM 표본을 준비하는 데에도 적용 할 수 있습니다.
Introduction
투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM)은 전통적인 광학 현미경 1 , 2 , 3 , 4 로 볼 수 없을 정도로 작은 생물 표본의 형태 및 초 미세 구조를 관찰하는 데 효과적인 도구입니다. TEM은 매우 얇은 표본을 통해 전자를 쏘아 전자가 빛보다 훨씬 짧은 파장을 가지므로 고해상도 이미지를 생성합니다. 전자를 구부리거나 차 단하는 샘플의 영역은 어둡게 보이고 전자 발광 인 영역은 흰색으로 보입니다.
전자 밀도가 낮 으면 전자를 산란시킬 수 없으므로 TEM 하에서 바이러스를보기가 어렵습니다. 음성 염색은 대조를 만들고 TEM으로 바이러스를 관찰하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법입니다. 최초의 음성 염색 절차는 Hall (1955)과 Huxley (1957)가 관찰 한 실험을 바탕으로 1959 년 Brenner와 Horne에 의해 제안되었다전자 밀도가 높은 물질에 잠길 때 역으로 대조되는 생물학적 구조의 출현 5 . 네거티브 얼룩의 과정은 지난 반세기 동안 사실상 변하지 않았습니다. 부정적인 염색 간단히 바이러스 6 침투하지 않고 고밀도 물질과 바이러스를 포위하기위한 시도의 TEM 그리드 샘플에 대한 중금속 염 용액을 적용하는 단계를 포함한다. 이것은 어두운 테두리를 만들고 입자의 모양을 드러냅니다 5 . 이 연구는 네거티브 염색을위한 2 가지 시약 인 uranyl acetate (UA)와 potassium phosphotungstic acid (PTA)를 사용합니다. 이 두 가지 얼룩은 일반적으로 바이러스, 단백질 복합체, 나노 입자 7 , 8 , 9 와 같은 작은 생물학적 시료를 부정적으로 오염시키는 데 사용됩니다.
기존의 음성 염색 기술은 수동 액적 음성 염색 기술입니다네크 7 . 이 방법은 작은 양의 바이러스 샘플, 얼룩 및 헹굼 물을 적용 할 수있는 집게가있는 작고 깨지기 쉬운 TEM 그리드를 정밀하게 처리해야합니다. 전형적인 준비 프로토콜은 필름 코팅 된 TEM 그리드 ( 그림 1A )의 표면에 샘플 현탁액을 떨어 뜨리는 것과 관련됩니다. 샘플을 필름 표면에 부착 한 후 그리드를 세척하여 비 점착성 바이러스를 제거하고 샘플 유형에 따라 몇 분에서 1 분 동안 UA 또는 PTA로 염색합니다. 그리드의 가장자리까지 여과지를 만져서 초과 액체가 그리드에서 멀리 떨어지게됩니다.
수동 물방울 방법은 각 그리드를 개별적으로 만들어야합니다. 조심스럽게 다루지 않으면 코팅 된 TEM 그리드는 쉽게 구멍이 뚫리거나 구부러 지거나 오염됩니다. 여러 샘플을 처리하면 그리드를 추적하는 데 어려움이 생길 수 있으며 각 샘플에 일관된 염색을 보장 할 수 있습니다. 이 수동 염색 절차는 훨씬 더 d이러한 환경에 필요한 개인 보호 장비 (PPE)로 인해 생물 안전성 수준 (BSL) -3 및 -4 생물 환경 실험실에서 수행 할 수없는 경우. PPE는 성 가시고 생체 환경은 일반 실험실에 비해 훨씬 혼란 스럽습니다. BSL-3 생물 공학 실험실에서 근무하는 인원은 2 쌍의 장갑을 착용하고 생물 안전성 캐비닛 (BSC)에서 작업해야합니다. 장갑의 이중층은 촉감 감도를 감소시키고 미세한 운동을 제한합니다. 사용자를 보호하고 샘플 오염을 방지하는 데 도움이되는 BSC의 공기 흐름은 샘플과 얼룩을 너무 빨리 말려서 얼룩 품질에 영향을 줄 수 있습니다. BSC의 강한 난기류는 또한 잘 보호되지 않은 그리드를 빠르게 날려 버릴 수 있습니다. BSL-4 생물 환경 실험실에서는 추가적인 안전 요구 사항이 있습니다. 작업자는 양압의 옷을 입어야한다. 신체적 인 움직임과 명확하게 보이고 조작 할 수있는 능력을 더 제한한다.그리드 그리드. BSL-4에서 일하는 기술자는 적어도 2 쌍의 장갑을 착용하고 외측 쌍은 두꺼운 장갑이어서 손재주와 촉각을 크게 감소시킵니다. 마지막으로, TEM 그리드를 처리하는 데 사용되는 집게는 날카 롭기 때문에 장갑을 뚫는 능력으로 인해 기술자에게 위험을 초래할 수 있습니다. 그리드가 포함 된 캡슐을 사용하면 포셉이 필요하지 않으므로 생체 적응에서 그리드를 조작하기위한 포셉이없는 안전한 대안을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 캡슐은 가공, 오스뮴 증기 오염 제거 및 보관 중에 그리드를 저장하는 효과적인 방법을 제공합니다. 그리드를 조직적으로 안전하게 유지하고 손상으로부터 보호합니다.
이 보고서에서는 mPrep / g 캡슐, 그리드 처리 및 염색을위한 캡슐 기반 장치 인 10 , 11 , 12 를 사용하는 생물학적 접근 실험실에서 TEM 그리드를 음성으로 오염시키는 새로운 방법을 소개합니다. 캡슐 받침목2 개의 TEM 그리드를 수정하고 직접 핸들링을 최소화하며 그리드 손상 가능성을 줄입니다. 캡슐은 피펫 팁과 동일한 방식으로 단일 또는 다중 채널 피펫에 직접 부착되어 다양한 액체를 내부의 그리드에 적용 할 수 있습니다. 이렇게하면 중복 그리드 ( 그림 1B )로 여러 샘플을 동시에 준비 할 수 있습니다. 캡슐로 음이온을 붙이려면 바이러스 샘플을 캡슐에 흡입하고 10 분간 보관하여 바이러스가 그리드 표면에 흡착되도록합니다. 흡착 된 바이러스가있는 그리드는이어서 탈 이온 (dI) 물로 세척하고 UA 또는 PTA로 수 초에서 1 분 동안 염색합니다. 이 프로세스는 수동 드롭 렛 방법과 동일한 프로토콜 단계 및 시약을 사용합니다. 차이점은 모든 작업이 그리드의 물리적 처리없이 캡슐 내부에서 발생한다는 것입니다. (도 1C , 1D ).
이 연구의 목적은 캡슐을생물학적 환경에서 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 새로운 방법. 이 연구는 또한 2 가지 다른 바이러스 불활 화 과정에서 생성 된 TEM 이미지의 품질을 조사했습니다 : 1) 1 % 오스뮴 테트 록 시드 증기를 이용한 급속 비활성화, 2) 2 % 글루 타르 알데하이드로 24 시간 불 활성화. 이 두 가지 모두 캡슐을 사용하여 실시되었습니다. 마지막으로 우리는 캡슐에 사용하기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 부식제 인 UA와 PTA를 평가했습니다. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
음성 염색은 바이러스, 단백질 복합체 및 나노 입자를 평가하고 크기를 정하는 데 유용한 TEM 기술입니다. 시약에서 네거티브 얼룩으로 수동 그리드 이동에 의한 이들 시편의 액적 준비는 반세기 이상 동안 고전적인 프로토콜이었습니다. 그것은 간단한 과정이지만, 성공적인 완료를 위해 훈련을 통해 얻은 전문 지식이 필요합니다. 탁월한 음성 염색은 여전히 최첨단 기술로 간주되며 많은 TEM …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
정제 된 에볼라 나노 -VLP를 제공 한 Dr. John Carra와 Rowena Schokman, Chikungunya 바이러스를 제공 한 Dr. Rajini Mudhasani 및 Ebolavirus glycoproteins을 발현하는 Murine Leukemia VLP를 제공 한 Dr. Charles (Jason) Shoemaker에 감사드립니다. 여름 인턴쉽 프로그램 (SIP) 및 과학 및 공학 견습 프로그램 (SEAP) 및 실험실 안전 교육을위한 Catherine Wilhelmsen 박사를 지원 한 MAJ Carl Soffler에게도 감사드립니다.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
References
- Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).
- Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).
- Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37 (2), 91-106 (2006).
- Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).
- Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).
- Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
- Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
- Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).
- Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).
- Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, 721 (2015).
- Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).
- Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, 174-175 (2011).
- Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
- Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).
- Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
- Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. , 403419 (2011).
- Barland, M., Rojkind, Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).
