Utnyttelse av kapsler for negativ farging av virale prøver innen biokonduksjon

Summary

Denne protokollen gir instruksjon for negative fargevirusprøver som lett kan brukes i BSL-2, -3 eller -4 laboratorier. Den inkluderer bruk av en nyskapende prosesseringskapsel, som beskytter transmisjonselektronmikroskopisk rutenett og gir brukeren enklere håndtering i de mer turbulente miljøene innen biokonstruksjon.

Abstract

Overføringselektronmikroskopi (TEM) brukes til å observere ultrastruktur av virus og andre mikrobielle patogener med nanometeroppløsning. De fleste biologiske materialer inneholder ikke tette elementer som er i stand til å sprede elektroner for å skape et bilde; Derfor kreves en negativ flekk, som plasserer tette tungmetallsalter rundt prøven. For å visualisere virus i suspensjon under TEM må de påføres små rister belagt med en gjennomsiktig overflate, bare nanometer tykk. På grunn av deres små størrelse og skjøthet er disse rutenettene vanskelige å håndtere og lett flyttes av luftstrømmer. Den tynne overflaten er lett skadet, slik at prøven er vanskelig eller umulig å bilde. Smittsomme virus må håndteres i et biosikkerhetsskap (BSC), og noen krever et biokonduktiv laboratoriemiljø. Staining-virus i biosikkerhetsnivåer (BSL) -3 og -4 er spesielt utfordrende fordi disse miljøene er mer turbulente og teknikere kreves tO Bruk personlig verneutstyr (PPE), noe som reduserer fingerfrekvensen.

I denne studien evaluerte vi en ny enhet som bidrar til negative farvingsvirusene i biokonvertering. Enheten er en kapsel som fungerer som en spesialisert pipettespiss. Når nettene er lastet inn i kapselen, aspirerer brukeren bare reagenser inn i kapselen for å levere viruset og flekker til det innkapslede rutenettet, og dermed eliminere brukerhåndtering av rister. Selv om denne teknikken ble designet spesielt for bruk i BSL-3 eller -4-biokonduksjon, kan det lette prøvepreparatet i alle laboratoriemiljøer ved å muliggjøre enkel negativ farging av virus. Den samme metoden kan også brukes til å lage negative TEM-prøver av nanopartikler, makromolekyler og lignende prøver.

Introduction

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er et effektivt verktøy for å vise morfologi og ultrastruktur av biologiske prøver som er for små til å bli sett med et tradisjonelt lysmikroskop ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEMs skyver elektroner gjennom en veldig tynn prøve som produserer et høyere oppløsningsbilde som elektroner har en mye kortere bølgelengde enn lys. Regioner av prøven som bøyer eller blokkerer elektroner virker mørke, mens områder som er elektronlukende, vises hvite.

Mangel på elektron tett materie gjør virus vanskelig å se under en TEM fordi de ikke kan spre elektroner. Negativ farging er den vanligste metoden som brukes til å lage kontrast og vise virus med en TEM. Den første negative fargingsprosedyren ble foreslått av Brenner og Horne i 1959, basert på et eksperiment hvor Hall (1955) og Huxley (1957) observertVed utseendet av biologiske strukturer i motsatt kontrast når de nedsenkes i et elektronisk tett stoff ⁵ . Prosessen med negativ farging har vært nesten uendret i løpet av det siste halve århundre. Negativ farging involverer kort bruk av en tungmetallsaltløsning til en prøve på et TEM-grid i et forsøk på å omgjøre viruset med tett materiale uten å infiltrere viruset ⁶ . Dette skaper en mørk kant og avslører partikkelens form ⁵ . Denne studien bruker to reagenser for negativ farging, uranylacetat (UA) og kaliumfosfotungstinsyre (PTA). Begge disse flekkene brukes ofte til å plette små biologiske prøver negativt, for eksempel virus, proteinkomplekser og nanopartikler ^{7 , 8 , 9} .

Den konvensjonelle negative fargingsteknikken er den manuelle dråpe negative fargingsteknikkenNique ⁷ . Denne metoden krever presis håndtering av små, skjøre TEM-rister med tau for å bruke små mengder virusprøve, flekker og skyll. Den typiske fremstillingsprotokoll innebærer å påføre en dråpe av prøve-suspensjon på overflaten av et filmbelagt TEM-grid ( figur 1A ). Etter festing av prøven til filmoverflaten, blir ruten skyllet for å fjerne ikke-vedhengende virus og farget med enten UA eller PTA i noen sekunder til et minutt, avhengig av typen av prøve. Overflødig væske er ugudelig fra rutenettet ved å berøre et stykke filterpapir til kanten av rutenettet.

Den manuelle dråpemetoden krever at hvert rutenett gjøres individuelt. Hvis ikke håndteres forsiktig, kan de belagte TEM-nettene enkelt punkteres, bøyes eller forurenses. Behandling av flere prøver kan føre til vanskeligheter med å spore gridene og sikre konsekvent farging for hver prøve. Denne manuelle fargingsprosedyren er mye mer dEffektiv når det utføres i biosikkerhetsnivå (BSL) -3 og -4 biokonduktivitetslaboratorier, på grunn av det nødvendige personlige verneutstyret (PPE) som kreves for disse miljøene. PPE er tungvint og biokontekstmiljøet er mye mer turbulent sammenlignet med et vanlig laboratorium. Personell som arbeider i BSL-3 biokonduktivitetslaboratorier, må bruke to par hansker og arbeide i et biosikkerhetskapasitet (BSC). Dette doble lag av hansker reduserer taktil følsomhet og begrenser fin motorbevegelse. Luftstrømmen av BSC som beskytter brukeren og bidrar til å forhindre prøveforurensning kan føre til at prøvene og flekkene tørker for raskt og dermed påvirker flekkkvaliteten. Den sterke turbulente luftstrømmen i BSC kan også raskt blåse bort et rutenett som ikke er godt sikret. I BSL-4 biokonduktivitetslaboratorier er det ytterligere sikkerhetskrav. Personell er pålagt å ha på seg en positiv trykkdrakt, noe som ytterligere begrenser fysisk bevegelse og evnen til å tydelig se og manipulereUlate grids. Teknikeren som arbeider i BSL-4, har også minst 2 par hansker, og det ytre paret er en tykk hanske som i stor grad reduserer fingerferdighet og taktil følelse. Til slutt er tangene som brukes til å håndtere TEM-grensesnitt, skarpe og derved utgir en risiko for teknikken på grunn av deres evne til å punktere hansker. Med kapsler som inneholder rister, er det ikke nødvendig å tvinge, noe som gir et trygt, taufritt alternativ for å manipulere rister i biokonstruksjon. Til slutt gir kapslene også en effektiv måte å lagre rister under prosessering, osmiumdampdekontaminering og under lagring; Herved holder nettene organisert og trygt fra skade.

I denne rapporten introduserer vi en ny metode for negativ farging av TEM grensesnitt i biokonduktivitetslaboratorier som benytter mPrep / g kapsler, en kapselbasert enhet for gridbehandling og farging ^{10 , 11 , 12} . Kapselene kommer til syneModifiserer to TEM-grensesnitt, minimerer direkte håndtering og reduserer potensialet for gridskader. Kapselet festes direkte til en enkelt- eller flerkanalspipett på samme måte som en pipettespiss, slik at det påføres forskjellige væsker i rister. Dette muliggjør samtidig forberedelse av flere prøver med dupliserte grid ( Figur 1B ). Til negativ flekk med kapsler aspireres virusprøven inn i kapselen og holdes i 10 minutter for å la virusene adsorbere på gridoverflatene. Ristene med adsorbert virus vaskes deretter med deionisert (dI) vann og farves med enten UA eller PTA i noen sekunder til 1 min. Denne prosessen bruker de samme protokollstrinnene og reagensene som den manuelle dråpemetoden; Forskjellen er at alt arbeid skjer i kapselen uten fysisk håndtering av gridene. ( Fig. 1C , 1D ).

Formålet med denne studien var å evaluere kapsler somEn ny metode for negativ farging av virusprøver i biokonduktiv miljø. Denne studien undersøkte også kvaliteten på TEM-bilder produsert av to forskjellige virusinaktiveringsprosedyrer: 1) hurtig inaktivering med 1% osmiumtetroksiddamp og 2) 24 timers inaktivering med 2% glutaraldehyd. Begge disse ble gjennomført ved bruk av kapslene. Til slutt vurderte vi to ofte brukte negative flekker, UA og PTA, for bruk i kapselen. ^{1. 3}

Protocol

1. Eksperimentering i et BSL-2 miljø før arbeid med virusprøver Forbered eller kjøp Formvar og karbonbelagt TEM kobbernettet, vanligvis 200-400 mesh. Sett de belagte TEM-nettene i kapsler. Bruk en forstørret linse for å gjøre denne prosessen enkel å utføre. Ett eller to gitter kan settes inn i hver kapsel. Pre-loaded kapsler kan kjøpes for å eliminere dette trinnet hvis ønskelig. Overfør kapslene med innfelt TEM-belagte rister, sammen med an…

Representative Results

Kapselmetoden gir god kvalitet negativ farging for TEM-bildebehandling: Først vurderte vi kvaliteten på bildene som ble generert ved å bruke både manuell dråpe-metoden og kapselmetodene for negativ farging av Zaire ebolavirus. Ebolaviruser er medlemmer av Filoviridae- familien, sammen med Marburg-viruset. Ebolavirus er typisk 80 til 100 nm i diameter og kan være over 1000 nm i lengde. Ebolavirus må håndteres i et…

Discussion

Negativ farging er en verdifull TEM-teknikk for evaluering og størrelse av virus, proteinkomplekser og nanopartikler. Dropletpreparering av disse prøvene ved manuell flytting av rister fra reagens til negative flekker har vært den klassiske protokollen i mer enn et halvt århundre. Det er en enkel prosess, men krever kompetanse oppnådd gjennom trening for vellykket gjennomføring. Utmerket negativ farging betraktes fortsatt som et toppmoderne ferdighetssett og svært ønsket i mange TEM-laboratorier. Kapselmetoden h…

Materials

Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/g couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM