सीटू में MHC-tetramer धुंधला और मात्रात्मक विश्लेषण स्थान, बहुतायत, और Phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण करने के लिए
Summary
यहाँ, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो सीटू MHC-tetramer में immunohistochemistry के साथ धुंधला कर स्थानीयकरण, phenotype, और ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए जोड़ती है. इस प्रोटोकॉल को अंय कक्ष प्रकार और संरचना के ऊतकों के सापेक्ष प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के स्थानिक और phenotypic विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
Abstract
टी कोशिकाओं कई प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, का पता लगाने और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को नष्ट करने, प्रतिरोधक क्षमता को रोकने, बी सेल में सहायता और एंटीबॉडी के प्लाज्मा सेल उत्पादन, और पता लगाने और कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने । MHC के विकास-tetramer प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के धुंधला प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण हमारे अध्ययन और टी कोशिकाओं के immunobiology समझने की क्षमता में क्रांति आई है । मात्रा और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की phenotype निर्धारित करने के लिए अत्यंत उपयोगी है, जबकि cytometry प्रवाह प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण अन्य कोशिकाओं और संरचनाओं के ऊतकों में, और वर्तमान एग्रीगेट तकनीक निर्धारित नहीं कर सकता टी कोशिकाओं प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक निकालने के लिए गैर-लसीकावत् ऊतकों में सीमित प्रभावशीलता है । सीटू में MHC-tetramer धुंधला (IST) के ऊतकों में ब्याज की एंटीजन के लिए विशिष्ट है कि टी कोशिकाओं को कल्पना करने के लिए एक तकनीक है । immunohistochemistry (आइएचसी) के साथ संयोजन में, IST बहुतायत, स्थान, और phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं का निर्धारण कर सकते हैं । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए दाग और antigen-विशिष्ट सीडी T कोशिकाओं की गणना, विशिष्ट ऊतक डिब्बों के भीतर स्थित विशेष phenotypes के साथ. इन प्रक्रियाओं हम ली एट अलद्वारा हमारे हाल ही में प्रकाशन में इस्तेमाल किया है कि एक ही हैं., हकदार “सिमियन इम्यूनो वायरस-कूप में कोशिकाओं के उत्पादन को आंशिक रूप से Vivo मेंसीडी+ कोशिकाओं द्वारा दबा रहे हैं.” वर्णित विधियों मोटे तौर पर लागू कर रहे है क्योंकि वे स्थानीयकरण, phenotype, और अनिवार्य रूप से कोई antigen-विशिष्ट सीडी टी सेल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो MHC tetramers, किसी भी ऊतक में उपलब्ध हैं ।
Introduction
टी कोशिकाओं कई प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, का पता लगाने और वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को नष्ट करने, प्रतिरोधक क्षमता को रोकने, बी सेल में सहायता और एंटीबॉडी के प्लाज्मा सेल उत्पादन, और पता लगाने और कैंसर की कोशिकाओं को नष्ट करने । पेप्टाइड/MHC वर्ग के विकास मैं प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं के धुंधला tetramer1 और MHC वर्ग द्वितीय के और अधिक हाल के विकास tetramer टी कोशिकाओं के धुंधला2 प्रवाह सीडी द्वारा हमारे अध्ययन करने और समझने की क्षमता क्रांति टी कोशिकाओं की immunobiology. मात्रा और प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं की phenotype निर्धारित करने के लिए अत्यंत उपयोगी है, जबकि प्रवाह cytometry अन्य कोशिकाओं और ऊतकों में संरचनाओं के लिए प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के स्थानिक स्थानीयकरण का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं देता, और वर्तमान प्रवाह cytometry के लिए आवश्यक टी कोशिकाओं को निकालने के लिए एग्रीगेट तकनीक गैर-लसीकावत् ऊतकों में सीमित प्रभावशीलता है3.
हम और दूसरों के लिए पेप्टाइड-लोड MHC वर्ग मैं और वर्ग द्वितीय tetramer या multimer रिएजेंट का उपयोग करने के तरीके विकसित किया है antigen-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं के ऊतकों में4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. इन IST विधियों स्थान, बहुतायत, और phenotype के ऊतकों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी और सीडी टी कोशिकाओं के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं और ऊतकों में अन्य कोशिकाओं और संरचनाओं के सापेक्ष इन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । हमारे समूह बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया है MHC-मैं मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) का अध्ययन करने के लिए धुंधला tetramer-और सिमियन इम्यूनो वायरस (SIV)-सीडी, जननांग, और मलाशय के ऊतकों में विशिष्ट लसीकावत् टी कोशिकाओं एचआईवी और SIV की समझ हासिल करने के लिए immunopathogenesis और सफल टीकाकरण रणनीतियों के14,15,16,17की पहचान को संबद्ध । इसके अलावा, हमने एक ऐसी तकनीक भी विकसित की है, जो सीटू संकरण (ISH) के साथ जोड़ती है और वायरस-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं और ऊतकों में वायरस-संक्रमित कोशिकाओं को स्थानीयकृत करती है और vivo effecter-to-लक्ष्य स्तरों को निर्धारित करता है 18 , 19.
यहाँ, हम का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन पेप्टाइड-लोड MHC-मैं tetramers का उपयोग कर नए ऊतक वर्गों में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं दाग करने के लिए, counterstain ऊतकों आइएचसी, और विशिष्ट ऊतक डिब्बों में विशिष्ट phenotypes के साथ कोशिकाओं को यों तो. इन प्रक्रियाओं के रूप में ही ली एट अलद्वारा हमारे हाल ही के प्रकाशन में इस्तेमाल किया गया है, जिसमें हम स्थान, बहुतायत, और मकाक20में जीर्ण SIV संक्रमण के दौरान लसीकावत् ऊतक में SIV विशेष टी कोशिकाओं के phenotype निर्धारित ।
इस प्रक्रिया के लिए, ताजा ऊतकों और खोदी है पेप्टाइड-भरी MHC के साथ रात भर की मशीन-मैं fluorescein thiocyanate अणुओं (FITC) के लिए संयुग्मित tetramers । वे तो paraformaldehyde में तय कर रहे हैं. ऊतक फिक्सिंग के बाद, MHC tetramers से संकेत खरगोश विरोधी FITC एंटीबॉडी का उपयोग कर परिलक्षित होता है और फ्लोरोसेंट टैग विरोधी खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी, जो आगे सीमा tetramers से संकेत बढ़ाना के साथ मशीन । आइएचसी IST प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं और आसपास के कक्षों की विशेषता के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है । एंटीबॉडी कि कोशिकाओं की सतह पर या extracellular अंतरिक्ष में epitopes पहचान tetramers के साथ प्राथमिक मशीन में शामिल हैं । एंटीबॉडी कि पहचान intracellular epitopes सेल दीवार के permeation की आवश्यकता है धुंधला करने से पहले । सना हुआ ऊतक वर्गों एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर imaged कर रहे है और फोकल सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण । लेबल कोशिकाओं मात्रा फोकल माइक्रोस्कोपी सॉफ्टवेयर या ImageJ का उपयोग कर रहे हैं । वर्णित प्रोटोकॉल के लिए अनिवार्य रूप से किसी भी ऊतक जो MHC-I tetramers उपलब्ध है में किसी भी प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी सेल दाग इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
1. दिन 1: ताजा ऊतक अनुभाग और प्राथमिक मशीन एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए छोटे में ताजा ऊतक कटौती (लगभग ०.५ सेमी चौड़ा द्वारा ०.५ सेमी लंबा) टुकड़े । अलग गोंद एक सवार के लिए प्रत्येक ऊतक और उंहें 4% कम ?…
Representative Results
Discussion
IST आइएचसी के साथ संयुक्त का पता लगाने, निस्र्पक, और अंय कोशिकाओं और ऊतक संरचनाओं के संदर्भ के साथ मूल वातावरण में प्रतिजन-विशिष्ट सीडी टी कोशिकाओं को बढ़ाता है के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है । यहा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह कार्य स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617) से सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान द्वारा समर्थित था.
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
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