In Situ MHC-tetramer färgning och kvantitativ analys att bestämma plats, överflöd och fenotyp av Antigen-specifika CD8 T-celler i vävnader
Summary
Här beskriver vi en metod som kombinerar i situ MHC-tetramer färgning med immunohistokemi att bestämma localizationen, fenotyp och kvantitet av antigen-specifika T-celler i vävnader. Detta protokoll används för att bestämma de rumsliga och fenotypiska egenskaperna av antigen-specifika CD8 T-celler i förhållande till andra celltyper och strukturer i vävnader.
Abstract
T-celler är kritiska till många immunologiska processer, inklusive att upptäcka och eliminera virus-infekterade celler, att förhindra autoimmunitet, bistå i B-cell och plasma-cell produktion av antikroppar, och att upptäcka och eliminera cancerceller. Utvecklingen av MHC-tetramer färgning av antigen-specifika T-celler som analyseras med flödescytometri har revolutionerat vår förmåga att studera och förstå immunobiology av T-celler. Medan extremt användbart för att bestämma kvantiteten och fenotyp av antigen-specifika T-celler, kan inte flödescytometri avgöra den rumsliga lokaliseringen av antigen-specifika T-celler till andra celler och strukturer i vävnader och nuvarande områdesindelningen tekniker för att extrahera T behövs celler för flödescytometri har begränsad effekt i icke-lymfoida vävnader. In situ MHC-tetramer färgning (IST) är en teknik för att visualisera T-celler som är specifika för antigener av intresse i vävnader. I kombination med immunhistokemi (IHC), kan IST bestämma överflöd, plats och fenotyp av antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader. Här beskriver vi ett protokoll för att fläcken och räkna upp antigen-specifika CD8 T-celler, med specifika fenotyper ligger inom specifika vävnad fack. Dessa förfaranden är detsamma som vi använde i vår senaste publikation av Li et al., med titeln ”Simian Immunodeficiency Virus-producerande celler i folliklar undertrycks delvis av CD8+ celler In Vivo.” De metoder som beskrivs är i stort sett tillämpliga eftersom de kan användas för att lokalisera, fenotyp och kvantifiera i huvudsak alla antigen-specifika CD8 T-cell som MHC tetramers finns, i alla vävnader.
Introduction
T-celler är kritiska till många immunologiska processer, inklusive att upptäcka och eliminera virus-infekterade celler, att förhindra autoimmunitet, bistå i B-cell och plasma-cell produktion av antikroppar, och att upptäcka och eliminera cancerceller. Utvecklingen av peptid/MHC klass I tetramer färgning av antigen-specifika CD8 T-celler1 och senare utveckling av MHC klass II tetramer färgning av CD4 T celler2 av flödescytometri revolutionerat vår förmåga att studera och förstå de Immunobiology av T-celler. Medan extremt användbart för att bestämma kvantiteten och fenotyp av antigen-specifika T-celler, tillåter flödescytometri inte för detektion av rumsliga localizationen av antigen-specifika T-celler till andra celler och strukturer i vävnader, och nuvarande områdesindelningen tekniker att extrahera T-cellerna behövs för flödescytometri har begränsad effekt i icke-lymfoida vävnader3.
Vi och andra har utvecklat metoder som använder peptid-loaded MHC klass I och klass II tetramer eller multimer reagens för att färga antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. dessa IST metoder för bestämning av plats, överflöd och fenotyp av antigen-specifika CD8 och CD4 T-celler i vävnader och ge ett medel för att upptäcka dessa celler i förhållande till andra celler och strukturer i vävnaderna. Vår grupp har i stor utsträckning används MHC-jag tetramer färgning för att studera humant immunbristvirus (HIV)- och simian immunodeficiency virus (SIV) – specifika CD8 T-celler i lymfatisk, genitala och rektal vävnader för att få en förståelse för HIV och SIV immunpatogenes och för att identifiera korrelerar lyckad vaccination strategier14,15,16,17. Dessutom kan utvecklat vi också en teknik som kombinerar IST med i situ hybridisering (ISH) för att lokalisera och kvantifiera virus-specifika CD8 T-celler och virus-infekterade celler i vävnader och effektor-to-target i vivo halter 18 , 19.
Här beskriver vi ett protokoll som använder peptid-loaded MHC-jag tetramers att fläcken antigen-specifika CD8 T-celler i färsk vävnad sektioner, till motfärg vävnader med IHC, och kvantifiera celler med specifika fenotyper i vävnad fack. Dessa förfaranden är samma som användes i vår senaste publikation av Li et al., där vi bestämt läge, överflöd, och fenotyp av SIV-specifika T-celler i lymfatisk vävnad under kronisk SIV infektion i makaker20.
För detta förfarande, färska vävnader är sektioneras och inkuberas över natten med peptid-loaded MHC-jag tetramers konjugerat med fluorescein kaliumtiocyanat molekyler (FITC). De är sedan fast i PARAFORMALDEHYD. Efter fastställande av vävnaden, förstärks signalen från de MHC-tetramers med kanin anti-FITC antikroppar och inkuberas med fluorescently märkta anti-kanin IgG-antikroppar, som ytterligare förstärker signalen från de bundna tetramers. IHC används i samband med IST för att karakterisera antigen-specifika T-celler och omgivande celler. Antikroppar som känner igen epitoper på ytan av celler eller i extracellulära ingår i den primära inkubationen med tetramers. Antikroppar som känner igen intracellulära epitoper kräver genomträngning av cellväggen före färgning. De färgade vävnadssnitt är avbildade med confocal Mikroskop och analyseras med hjälp av confocal programvara. Märkt celler är kvantifierade använder konfokalmikroskopi programvara eller ImageJ. Protokollet beskrivs kan användas för att färga i huvudsak en antigen-specifika CD8 T cell i vilken vävnad för vilka MHC-jag tetramers är tillgängliga.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST kombinerat med IHC ger ett viktigt verktyg för att identifiera, karakterisera och kvantifiera antigen-specifika CD8 T-celler i inhemska miljöer med ramen av andra celler och vävnad strukturer. Här beskrivs vi detaljerade förfaranden för IST kombinerat med IHC, följt av kvantitativ bildanalys, att bestämma plats, överflöd och fenotyp av antigen-specifika CD8 T-celler i lymfkörtlarna från rhesus makaker. Liknande färgning kan tillämpas på människa, mus eller andra arter vävnader för vilka MHC-jag tetr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Public Health Service bidrag från National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
