Laboratoriet protokol for genetiske Gut indhold analyser af akvatiske Macroinvertebrates brug af gruppe-specifikke rDNA primere

Summary

Mest almindelige gut indhold analyser af macroinvertebrates er visuel. Der kræver intens viden om morfologiske diversitet af organismer, byttedyr, de savner bløde trehjulet bytte og, på grund af stærk comminution af byttedyr, er næsten umuligt for visse organismer, herunder amfipoder. Vi leverer detaljerede, Roman genetiske metoder til macroinvertebrate bytte identifikation i kosten af amfipoder.

Abstract

Analysere mad webs er afgørende for en bedre forståelse af økosystemerne. For eksempel kan mad web interaktioner gennemgå alvorlige ændringer forårsaget af invasionen af fremmede arter. En nøjagtig identifikation af feltet rovdyr-byttedyr interaktioner er imidlertid vanskeligt i mange tilfælde. Disse analyser er ofte baseret på en visuel vurdering af gut indhold eller analyse af stabile isotop nøgletal (δ¹⁵N og δ¹³C). Sådanne metoder kræver omfattende viden omkring, henholdsvis, morfologiske forskellighed eller isotopiske signatur fra individuelle bytte organismer, fører til hindringer i den nøjagtige identifikation af bytte organismer. Visuelle gut indhold analyser undervurdere især bløde trehjulet bytte organismer, fordi maceration, indtagelse og fordøjelse af bytte organismer gør identifikation af specifikke arter vanskeligt. Dermed, polymerase kædereaktion (PCR) baseret strategier, for eksempel brugen af gruppespecifikke primer sæt, giver et stærkt værktøj til undersøgelse i food web interaktioner. Her, beskriver vi detaljerede protokoller for at undersøge gut indholdet af macroinvertebrate forbrugere fra feltet gruppe-specifikke primer sæt for nuklear ribosomale deoxyribonukleinsyre (rDNA). DNA kan være udvundet enten fra hele enheder (for lille taxa) eller tarm indholdet af prøver indsamlet i feltet. Tilstedeværelse og funktionelle effektivitet af DNA skabeloner skal bekræftes direkte fra den testede enkelte ved hjælp af universelle primer angiver målretning de respektive underenhed af DNA. Vi viser også, at forbruges bytte kan bestemmes yderligere ned til artsniveau via PCR med umodificerede gruppe-specifikke primere kombineret med efterfølgende enkelt streng kropsbygning polymorfi (SSCP) analyser ved hjælp af polyacrylamidgeler. Derudover viser vi, at anvendelsen af forskellige fluorescerende farvestoffer som etiketter muliggør parallel screening for DNA fragmenter af forskellige bytte grupper fra flere gut indhold prøver via automatiseret fragment analyse.

Introduction

Rovdyr-byttedyr interaktioner, der udgør flertallet af trofiske interaktioner og fødekæde dynamik, er centrale aspekter til at karakterisere strømme af stof og energi i hele fødevarer webs inden for og mellem økosystemer, som er et af de vigtigste mål for økologi ¹. bestemmelse af kilden og strømmen af carbon og næringsstoffer fremme forståelsen af økologiske forbindelser mellem økosystemer². Dog er økosystemer, som floder og deres afvandingsområder, ikke kun forbundet af strømme af organisk stof og næringsstoffer, men også af flytninger af organismer³. Således kan habitat ændringer afbryde strømmen af ressourcer, som forbinder disse systemer kraftigt ændre mad spind af begge økosystemer, ikke kun direkte, men også indirekte ved at ændre de respektive sammensætning af rovdyr-byttedyr Fællesskaber. For eksempel, har ændringer af mad webs vist sig at være knyttet til bevægelser af enkelt rovdyr arter (fx, regnbueørred)⁴. Sådanne ændringer truer potentielt biodiversiteten og funktion af akvatiske økosystemer. Derfor er analysere rovdyr-byttedyr interaktioner i feltet afgørende for at bestemme virkningen af menneskeskabte miljøforandringer såsom vand ledelsespraksis, på den indfødte biodiversitet af akvatiske økosystemer.

Da tracking trofiske forbindelser er vanskeligt i komplekse systemer, har flere tilgange fastslået at muliggøre vurdering af fodring interaktioner i felt⁵. Traditionelt, undersøgelser af fodring interaktioner i feltet er baseret på visuelle identifikation af bytte forbliver i dissekeret indvolde og kræver en omfattende viden om morfologiske bytte mangfoldighed. Visuelle gut indhold analyser har givet indsigt i ressourceudnyttelsen af flere grupper af forbrugere (f.eks. sæsonvariation i kost af hummer⁶ og fisk^7,8 eller fodring præferencer af vandlopper). Dog den fysiske processen med fordøjelsen vanskeliggør visuelle gut indhold analyser og normalt misser bløde trehjulet bytte-organismer⁹. For arter fodring af flydende indtagelse eller visse hvirvelløse forbrugere, der intensivt comminute deres mad før indtagelse, ligesom amfipoder, er visuelle identifikation af byttedyr i tarm indholdet umuligt¹⁰. På grund af disse begrænsninger giver Molekylær analyse en lovende alternativ.

Molekylære analyser er nu blevet en fælles værktøj giver mulighed for hurtig og præcis bytte påvisning i tarm indholdet. Rækken af sådanne teknikker er mangfoldige: strategier baseret på monoklonale antistoffer eller polymerase kædereaktion (PCR) anvendes ofte, på grund af deres høje specificitet og sensitivitet¹¹. Udvikling af nye monoklonale antistoffer er tid – og omkostningskrævende, derfor anvendelsen af andre molekylære teknikker er mere nyttigt når antistoffer ikke allerede findes¹¹. En anden fælles tilgang er forstærkningen af regioner af deoxyribonukleinsyre (DNA), ligesom ribosomale ribonukleinsyre (RNA) gener til stede i de fleste arter, ved hjælp af universelle primer sætter^12,13. Når du bruger denne teknik, er det ofte ikke muligt at identificere en lang række bytte organismer inden for blandet kilder af DNA¹⁴. En effektiv metode til at undgå sådan en ulempe er, at bruge gruppe-specifikke primer sætter for genetiske gut indhold analyser. Designet til at forstærke kun DNA regioner af bestemte målgrupper og udelukke alle andre arter^15,16, aktiverer gruppe-specifikke primere identifikation af bytte organismer på den taksonomiske niveau af de angivne grupper uden tid – og omkostningskrævende sekundære analyser. Men ligesom alle gut indholdsanalyse, sådanne analyser giver kun et øjebliksbillede af fodring adfærd. Derfor anses kombinerer molekylære gut indhold analyser med analyser af tid-integrere naturlige sporstoffer (fx stabile isotoper) gavnlige^1,2.

Her beskriver vi en detaljeret metode til PCR-baserede undersøgelser af rovdyr-byttedyr interaktioner ved hjælp af gruppespecifikke primer sæt for nuklear ribosomale DNA (rDNA) regioner skal kombineres med stabil isotop analyser af det samme prøvemateriale. Vi beskriver påvisning af enkelt bytte grupper via Agarosen gelelektroforese DNA. Derudover præsenterer vi en mulighed for videre downstream analyse af PCR produkter af sådanne gruppe-specifikke primere gældende, når en højere taksonomiske opløsning end primere specificitet er påkrævet. Fordi enkelt strandede DNA (ssDNA) fragmenter form tertiære konformationer, der bestemmes af deres primære sekvens¹⁷, medføre små variationer i fragmenter forstærkes af sådanne gruppe-specifikke primere konformationelle ændringer. Sådanne ændringer kan påvises ved enkelt streng kropsbygning polymorfi (SSCP) analyser med polyacrylamidgeler^17,18, muliggør en mere præcis identifikation af bytte organismer (ned til artsniveau).

Mens Agarosen gelelektroforese er en fælles og billig værktøj til at visualisere DNA fragmenter og bestemme deres omtrentlige længde¹⁹, løsningen afhænger af mængden af DNA og farvning farvestoffet anvendes²⁰. Normalt, visualisering er ligetil når du arbejder med ren DNA-prøver, men potentielt lave mængder af byttedyr DNA i tarm indholdet af forbrugerne kan komplicere scoring af Agarosen gel elektroforese resultater. Stadig, denne metode til påvisning er muligt at screene et lavt antal forbruger prøver fra feltet for en eller et par bytte grupper, men komplikation i den scoring gør screening af et stort antal prøver for flere bytte taxa meget tid intensiv og dermed upraktisk. En mere følsom metode til påvisning er en automatiseret analyse af fragmenter via kapillar elektroforese, som Derudover giver mulighed for bestemmelse af den nøjagtige længde af fragmenter²¹. Flere microsatellite baseret undersøgelser har vist, at det ved hjælp af forskellige fluorescerende farvestoffer som etiketter, er muligt at påvise og bestemme forskellige fragmenter af tilsvarende længde af automatiserede fragment analyse^{22,23, 24}. Derfor, vi også fremlægge en detaljeret protokol for parallelle påvisning af DNA fra flere bytte grupper ved hjælp af PCR med mærket gruppespecifikke primer sæt og registrering via automatiseret fragment analyse med en automatiseret sequencer. Derudover præsenterer vi resultaterne fra et casestudie viser, at påvisning af bytte DNA via automatiseret fragment analyse er en tilgang, som også giver en relativ kvantificering af indtagne bytte.

Protocol

1. indsamle Macroinvertebrates fra marken og forberede prøverne for genetiske Gut indhold analyser. Indsamle macroinvertebrates på hver lokalitet, sortere ud individer af consumer art af interesse i enkelt rør, og direkte fryse dem i flydende nitrogen eller tøris til at forhindre gut clearance og nedbrydning af DNA. Bemærk: Undgå at gemme prøver i alkohol, fordi nogle macroinvertebrates har tendens til at gylpe før alkohol dræber dem. Kun bruge mave-og tarmkanal af mellemstore…

Representative Results

Vi har med held brugt trin, der beskrives i denne protokol for kost analyser inden for forskellige undersøgelser. I dette afsnit præsenterer vi eksempler der beskriver anvendelsen af de forskellige dele af protokollen. Som et eksempel, for at demonstrere effektiviteten af gruppespecifikke primer sæt etableret af forfatterne28 og mulighederne for videre downstream analyse af PCR-produkter af SSCP analys…

Discussion

Her præsenterer vi en let og omkostningseffektiv metode til PCR-baserede bestemmelse af rovdyr-byttedyr interaktioner fra feltprøver via gruppe-specifikke primere for rDNA regioner, som kan kombineres med andre ikke-molekylære analyser af de samme enheder. Der er imidlertid adskillige kritiske trin i protokollen. For det første er forsikre specificiteten af primere bruges afgørende. For det andet er det afgørende at undgå kontaminering og tab af tarm indholdet materiale under udarbejdelse af mave-tarmkanalen og ef…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.