Vi beskriver brugen af laser fange microdissection at få prøver af forskellige cellepopulationer fra forskellige hjerneregioner for gen og mikroRNA analyse. Denne teknik giver mulighed for undersøgelse af differentiale virkninger af traumatisk hjerneskade i specifikke områder af hjernen, rotte.
Evnen til at isolere specifikke hjerneregioner interesse kan hindres i væv afstandtagen teknikker, der ikke bevarer deres geografiske fordeling. Sådanne teknikker skew også potentielt gen expression analyse fordi selve processen kan ændre udtryk mønstre i individuelle celler. Her beskriver vi en laser fange microdissection (LCM) metode at selektivt samle specifikke hjerneregioner ramt af traumatisk hjerneskade (TBI) ved hjælp af en modificeret Nissl (cresyl violet) farvning protokol og vejledning af en rotte hjernen atlas. LCM giver adgang til hjerneregioner i deres oprindelige positioner og evnen til at bruge anatomiske landemærker til identifikation af hver enkelt specifik region. Med henblik herpå, er LCM tidligere blevet brugt til at undersøge hjernen regionen specifikke genekspression i TBI. Denne protokol giver mulighed for undersøgelse af TBI-inducerede ændringer i genet og mikroRNA udtryk i distinct hjernen områder inden for den samme dyr. Principperne i denne protokol kan ændres og anvendes til en lang række studier undersøger genomisk udtryk i andre sygdomme og/eller dyremodeller.
Pattedyr hjernen er bemærkelsesværdigt kompleks og heterogen med hundreder til tusinder af celle typer1. Faktisk, humane undersøgelser har vist, at i regioner som den frontale cortex, strukturelle og funktionelle forskelle i hvide og grå sagen afspejles i forskellige og divergerende transcriptional profiler2. Hjernen heterogenitet har været en væsentlig hindring for fortolke genekspression data og inden for hjerneskade. Denne tvetydighed i prækliniske undersøgelser har efterfølgende ført til hundredvis af mislykkede kliniske forsøg for behandlinger af hjerne skade3.
Vi bruger laser fange microdissection (LCM) metoder til at studere traumatisk hjerneskade (TBI)-induceret gen dysregulering i rotte hjernen4, med fokus på hippocampus, et område af hjernen, der er afgørende for indlæring og hukommelse5. Evnen til at laser opsamling og analysere genekspression i både dør og overlevende neuroner giver os en større forståelse af rollen, som stochasticity i genekspression bestemme resultatet (neuronal overlevelse) efter TBI6. LCM teknikker har også vist sig nyttige for at udforske virkningerne af TBI på Hippocampus neuroner, når man sammenligner unge og aldrende mus7 eller rotter8.
I nyere undersøgelser undersøgte vi andre regioner af rotte hjernen negativt påvirket af TBI, med fokus på områder i rotter og menneskelige TBI patienter, der er forbundet med udøvende funktion (dvs. frontale cortex9) og TBI co-morbiditet; disse co-morbiditet omfatter depression(dvs. nucleus accumbens10) og døgnrytme lidelser (suprachiasmatic kernen11). I tidligere undersøgelser, Huusko og Pitkanen12 og Drexel et al. 13 bruges LCM for at undersøge genekspression i thalamus og hypothalamus. Vores undersøgelse bygger på disse forudgående observationer og indeholder fire andre områder af hjernen. For at studere de region-specifikke molekylære ændringer induceret efter TBI, var det nødvendigt at opnå ekspertise i at identificere og opnå celletyper i disse områder ved hjælp af en LCM-systemet. De UV-skæring og infrarød (IR) lasere tillade præcise microdissection af ønskede hjerneregioner. Her beskriver vi, hvordan vi bruger denne LCM-systemet, styret af stereotaxisk koordinater i rotte hjernen atlas14for at identificere og laser fange fire rotte hjerneregioner, der berøres varierende eksperimentelle væske-percussion hjerne skade metode 4.
For molekylære studier af pattedyr hjernen, er LCM blevet en afgørende teknik. Denne artikel viser, at ved hjælp af kombinationen af UV og IR skæring lasere i LCM-systemet kan fange genomisk ændringer i nogen region af hjernen, pattedyr. Disse områder omfatter de identificerbare med konventionelle LCM-kompatible pletter, som cresyl violet eller hæmatoxylin og eosin. Hastigheden af de laser-capture proces og evne til at udføre LCM på tykkere 30 µm sektioner på PEN membran dias tillader ikke kun få tilstrækkelige mængder af celle prøver, men også at isolere RNA fra LCM prøver af en passende kvalitet til alle typer af downstream Genomisk analyse; disse analyser omfatter microarrays16, PCR arrays17og kvantitative real-time PCR18.
Vores data giver et rationale for undersøgelser, der anvender LCM’EN væv. Vi finder at miR-15b er upregulated i hippocampus og cortex (figur 4), men downregulated i kernen accumbens og kan være biologisk relevante for forståelsen af differential virkningerne af TBI i hjernen. En tidligere undersøgelse antydede, at stigninger i kortikale neuronal sårbarhed over for skade skyldes overekspression af flere miRNAs, der negativt regulerer Pro overlevelse gener, som Bcl-219. Target scan analyse viser Bcl-2 er også reguleret af miR-15b; således, vores data tyder på en mekanistisk forklaring på hvorfor bestemte regioner af hjernen (dvs., FCx) kan være selektivt sårbare over for TBI. Det er vigtigt at huske de fleste gener er reguleret af flere miRNAs og korrelerede ændringer i enhver én miRNA til et bestemt mål-genet er vanskeligt. Disse data viser desuden, at visse ændringer i genet og microRNA expression kan bruges som biomarkører for regionsspecifikke hjerneskade. Ja, vi i øjeblikket bruger disse data i studier af hvordan nye neuroprotektive drug forbindelser med antidepressiv egenskaber kan varierende påvirke gen og microRNA expression i hjerneregioner forbundet med neuropsykiatriske lidelser. En begrænsning af vores undersøgelse er, at under de flere trin af dias tilberedningsprocesser for LCM, RNA integritet kan blive kompromitteret. Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at mindske risikoen for RNA nedbrydning. En anden begrænsning er relativt lille prøvestørrelse anvendes til statistiske beregning. I fremtiden bør undersøgelser, øge stikprøvestørrelse mindske virkningerne af genet og miRNA udtryk variationer blandt enkelte dyr.
Gavn for LCM er realiseret i translationel genomisk undersøgelser ved hjælp af dyremodeller for humane sygdomme og syge væv20,21,22,23. Uden evnen til at fange specifikke cellepopulationer, ville transcriptional profiler af forskellige hjerneregioner være en ukendte og undecipherable blanding af mange celletyper. Ved hjælp af LCM metoder i hjernen skade undersøgelser har ført til igangværende bestræbelser på at afgrænse hjernen regionen specifikke biomarkører og forstå, hvordan de korrelerer med cirkulerende biomarkører til TBI.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende Elizabeth Sumner for hendes hjælp til redigering af dette manuskript. Finansieringen af dette projekt blev fastsat i en del af The Moody projekt translationel traumatisk hjerne skade forskning og RO1NS052532 til HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |